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        復合酶協(xié)同超聲輔助提取東北土當歸葉中總黃酮及其抑菌活性的研究

        2021-10-18 03:21:24吳淑清艾叢蘋欒茗然朱文秀
        江蘇調(diào)味副食品 2021年3期
        關(guān)鍵詞:黃酮實驗

        吳淑清,艾叢蘋,欒茗然,朱文秀

        (1.長春大學 食品科學與工程學院,吉林 長春 130022;2.浙江李子園食品股份有限公司,浙江 金華 321000)

        東北土當歸,學名長白楤木,又稱草本刺嫩芽、狗苦龍芽等[1],營養(yǎng)物質(zhì)極為豐富,既是山野菜,又是中草藥。古醫(yī)書記載其根可入藥,具有祛風燥濕、解熱鎮(zhèn)痛、疏風活血和利尿解毒等功效[2]。東北土當歸中黃酮類化合物和苷類化合物具有較強的抗氧化活性[3],貝殼烯酸、貝殼杉醇酸、海松酸等二萜成分具有鎮(zhèn)靜作用[4]。此外,其葉中含有的某些成分具有降血壓、降血糖、抗炎鎮(zhèn)痛、預防心腦血管疾病、延緩衰老和保護神經(jīng)系統(tǒng)等功效[5]。

        復合酶協(xié)同超聲波提取東北土當歸葉中總黃酮的原理是,酶可破壞植物組織細胞,使細胞壁破裂,從而降低與溶劑之間的傳質(zhì)阻力[6]。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        東北土當歸:由長春大學園林學院王曉紅教授的實驗種植基地提供;蘆丁標準品:國藥集團化學試劑有限公司;纖維素酶(400 U/mg)、果膠酶(50000 U/g):美國sigma公司;無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉:天津市福晨化學試劑廠,均為分析純;牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉:北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

        供試菌種:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌,均為長春大學實驗室留存菌種。

        1.2 儀器與設(shè)備

        WJX-A1000型高速多功能粉碎機:上海緣沃工貿(mào)有限公司;超聲波清洗器:深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司;721型可見分光光度計:日本島津儀器有限公司;TDL-50B低速離心機:上海安亭科學儀器廠。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 東北土當歸葉預處理

        將新鮮東北土當歸葉清洗干凈,自然曬干后,置于粉碎機中粉碎,再過40目(0.425 mm)篩,裝入密封袋,冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.2 總黃酮提取工藝流程

        東北土當歸葉總黃酮提取工藝流程見圖1。

        圖1 東北土當歸葉總黃酮提取工藝流程

        1.3.3 標準曲線的制作

        將蘆丁標準品經(jīng)110 ℃干燥至恒重,冷卻至室溫備用。稱取蘆丁標準品10 mg,用30%乙醇于50 mL容量瓶中定容,超聲溶解5 min,可得濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準品溶液,冷藏保存?zhèn)溆?。分別吸取蘆丁標準品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL的比色管中,各加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL、10%硝酸鋁溶液1 mL、1 mol/L氫氧化鈉10 mL,最后用50%乙醇定容至刻度線,搖勻,放置10 min,于510 nm處測定吸光度[7],繪制標準曲線。得到回歸方程:y=10.232x+0.0049(R2=0.9992),式中,y為吸光度,x為蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL)。結(jié)果表明,蘆丁標準品溶液濃度為0.01~0.05 mg/mL時,與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

        1.3.4 東北土當歸葉總黃酮的測定

        吸取5 mL樣液于25 mL容量瓶中,其他操作按照制作標準曲線的方法處理。計算東北土當歸葉中總黃酮含量,公式如下:

        式中,T:總黃酮物質(zhì)的含量,mg/g;C:總黃酮質(zhì)量濃度,mg/mL;V:總黃酮提取液體積,mL;m:樣品質(zhì)量,g;n:稀釋倍數(shù)。

        1.3.5 單因素實驗和正交試驗

        采用復合酶協(xié)同超聲波提取法從東北土當歸葉中提取總黃酮,以總黃酮提取量作為衡量標準,確定各因素的最適范圍。單因素實驗因素水平見表1。

        表1 單因素實驗因素水平

        在單因素實驗的基礎(chǔ)上,設(shè)計L9(34)正交試驗,以確定總黃酮的最佳提取工藝。正交試驗因素水平見表2。

        表2 正交試驗因素水平

        1.3.6 總黃酮提取液的抑菌試驗

        吸取0.1 mL無菌水,將菌液稀釋為0.5個麥氏比濁度的菌懸液,再用移液槍吸取100 μL稀釋菌液滴加在平板上,用涂布棒將菌液均勻涂布在滅菌平板上。用無水乙醇將總黃酮提取液分別稀釋成不同濃度,將滅菌后的濾紙片浸泡在提取液中1 h,于紫外燈下照射20 min。用無菌鑷子夾取濾紙片,3片一組等間距放在培養(yǎng)基上。用浸有無菌水的濾紙片做對照,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取出后觀察是否有透明圈[8]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素實驗結(jié)果

        2.1.1 復合酶比例對總黃酮提取量的影響

        由圖2可知,當復合酶(纖維素酶/果膠酶)比例為1∶2時,總黃酮提取量達到最大值。纖維素酶占比的增加能更好地破壞東北土當歸葉的細胞壁,使得細胞中的總黃酮物質(zhì)更好地溶出;但纖維素酶占比過高時,底物濃度不能使復合酶達到飽和狀態(tài),復合酶的作用會受到抑制,進而導致總黃酮提取量降低[9]。

        圖2 復合酶比例對總黃酮提取量的影響

        2.1.2 料液比對總黃酮提取量的影響

        由圖3可知,當料液比為1∶40(g/mL)時,總黃酮提取量達到最大值。但隨著溶劑量的增加,一方面總黃酮類物質(zhì)的溶出量有限;另一方面溶劑過多會導致其他雜質(zhì)的大量溶出,而有些雜質(zhì)與總黃酮類物質(zhì)之間存在拮抗作用,會影響提取效果[10]。

        圖3 料液比對總黃酮提取量的影響

        2.1.3 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

        由圖4可知,當乙醇濃度為40%時,總黃酮提取量達到最大值。根據(jù)相似相溶的原理,極性越接近,溶解度越大。當乙醇濃度為40%時,溶劑的極性和黃酮的極性最為接近,黃酮溶解度最大[11]。

        圖4 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

        2.1.4 超聲溫度對總黃酮提取量的影響

        由圖5可知,當超聲溫度為50 ℃時,總黃酮提取量達到最大值。適當升高溫度有利于總黃酮類物質(zhì)的溶出;但過高的溫度會導致總黃酮類物質(zhì)氧化和降解,使提取量下降[12]。

        圖5 超聲溫度對總黃酮提取量的影響

        2.2 正交試驗結(jié)果

        在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗,試驗結(jié)果見表3。

        表3 正交試驗結(jié)果

        由表3可知,影響總黃酮提取量的四個因素的主次順序為乙醇濃度>料液比>復合酶比例>超聲溫度,最佳提取工藝條件為A3B1C3D2,即復合酶比例2∶1、料液比1∶30(g/mL)、乙醇濃度50%、超聲溫度50 ℃。

        2.3 驗證實驗

        對正交試驗得到的最佳工藝條件進行驗證實驗。經(jīng)過三次平行實驗,實際測得總黃酮提取量為12.6 mg/g,與預測值相近,說明工藝優(yōu)化得到的技術(shù)參數(shù)是穩(wěn)定可靠的。

        2.4 抑菌試驗結(jié)果

        由表4可知:當稀釋濃度倍數(shù)高于1/4時,兩種細菌均有透明抑菌圈,表明總黃酮提取液對兩種細菌均有不同程度的抑制作用;當稀釋濃度倍數(shù)為1/4時,金黃色葡萄球菌周圍幾乎沒有抑菌圈,隨著總黃酮濃度的降低,抑菌圈也減小至無;當稀釋濃度倍數(shù)為1/8時,沒有抑菌效果。由以上結(jié)果可以得出,對金黃色葡萄球菌的抑菌濃度為0.5 mg/mL,對大腸桿菌的抑菌濃度為0.25 mg/mL。

        表4 總黃酮提取液抑菌試驗結(jié)果

        3 結(jié)論

        本研究以東北土當歸葉為原料,以乙醇溶液為溶劑,采用復合酶(纖維素酶/果膠酶)協(xié)同超聲波提取東北土當歸葉中總黃酮。通過單因素實驗和正交試驗,確定最佳提取工藝:復合酶比例2∶1、料液比1∶30 (g/mL)、乙醇濃度50%、超聲溫度50 ℃。在此條件下,總黃酮提取量達到最大值,為12.6 mg/g。通過抑菌試驗證明東北土當歸葉總黃酮有良好的抑菌作用,對金黃色葡萄球菌的抑菌濃度為0.5 mg/mL,對大腸桿菌的抑菌濃度為0.25 mg/mL。

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