王保寧， 陳昱作， 貢 嘎， 羅潤(rùn)波， 周賽賽， 李天嬌， 索朗斯珠

(1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院， 成都 610041；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院， 林芝 860000)

1 引 言

牦牛(Yak，Bosgrunniens)是高寒地區(qū)的特有牛種，草食性反芻動(dòng)物，也是我國(guó)的主要牛種之一，其大多數(shù)集中于青藏高原中心地帶及東部邊緣的青海、甘肅和四川西北部[1]. 不同地區(qū)的牦牛分布的海拔存在較大的差異[2]. 牦牛是高寒牧區(qū)畜牧業(yè)中最重要的畜種之一[3]. 由于高海拔地區(qū)低溫高寒、草木結(jié)構(gòu)單一、季節(jié)不平衡，寒冷季節(jié)飼草飼料儲(chǔ)備缺乏等原因，牦牛常常表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)不良，體重出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)[4]. 近年來(lái)，高海拔牦牛向低海拔遷徙，在低海拔地區(qū)建設(shè)圈舍，采用舍飼培育牦牛，正成為發(fā)展牦牛產(chǎn)業(yè)的一個(gè)創(chuàng)新措施[5]. 本文采用宏基因組測(cè)定分析技術(shù)對(duì)不同海拔地區(qū)的牦牛腸道菌群組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較研究，初步探索了高低不同海拔區(qū)域內(nèi)的牦牛腸道菌群結(jié)構(gòu)組成，為高低不同海拔區(qū)域內(nèi)的牦牛遷徙和飼喂提供了腸道微生態(tài)研究基礎(chǔ).

2 材料與方法

2.1 樣本采集

隨機(jī)采集西部不同海拔區(qū)域的12頭成年牦牛的新鮮糞便，其中海拔3 000 m以下地區(qū)歸為低海拔組(LA)，平均海拔2942.5，樣本4例，海拔4 000 m以上地區(qū)歸為高海拔組(HA)，平均海拔4 372.5，樣本8例. 取樣后立即存于液氮中. 樣本信息見(jiàn)表1.

表1 樣本來(lái)源

2.2 方 法

2.2.1 樣品處理與DNA提取 將待測(cè)樣本中加入1 mL 65 ℃預(yù)熱的CTAB提取液，震蕩混勻，常規(guī)乙醇法提取DNA，加入50～100 μL含10 mg/mL RNase的無(wú)菌ddH2O，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴鍋消化1 h后保存在-20 ℃冰箱.

2.2.2 16s rDNA擴(kuò)增與擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化 采用細(xì)菌16s rDNA V3+V4區(qū)域通用引物[6]：上游338F： 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，下游806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，25 μL體系：模板50 ng，上下游引物各2.5 μL，Pusion Hot start flex 2×Master Mix 12.5 μL. 擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃ 10 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，于4 ℃保存. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收，回收采用AxyPrep PCR Cleanup Kit回收.

2.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物定量混樣上機(jī)測(cè)序及物種分析 對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物采用Quant-iTPicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量，合格的文庫(kù)濃度應(yīng)在2 nmol/L以上. 將合格的各上機(jī)測(cè)序文庫(kù)(Index序列不可重復(fù))梯度稀釋后，根據(jù)所需測(cè)序量按相應(yīng)比例混合，并經(jīng)NaOH變性為單鏈進(jìn)行上機(jī)測(cè)序；使用MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測(cè)序，相應(yīng)試劑為MiSeq Reagent Kit V3 (600 cycles). 將獲得的序列在NCBI BLAST 數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)后獲得物種信息.

2.2.4 數(shù)據(jù)分析 基于操作分類單元(Operational Taxonomic Units, OTU)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算樣品的alpha多樣性，用來(lái)分析物種變化趨勢(shì). 根據(jù)物種特異基因豐度表和物種注釋表，從門(mén)、綱、目、科、屬、種水平，對(duì)相對(duì)OTU豐度進(jìn)行聚類分析，用t檢驗(yàn)對(duì)高低海拔組間相對(duì)豐度的進(jìn)行差異分析.

3 結(jié) 果

3.1 高低不同海拔牦牛腸道菌群結(jié)構(gòu)總體差異

分析測(cè)序12個(gè)樣本的OTU，高低海拔OTU共有5 322個(gè)，其中高海拔4 237個(gè)，低海拔4 824個(gè)，高低海拔共有的為3 739個(gè)，高海拔牦牛特有的腸道菌群為498個(gè)，低海拔牦牛特有的微生物為1 085個(gè)，低海拔牦牛腸道菌群比高海拔牦牛腸道菌群種類高出587個(gè).

3.2 不同分類水平對(duì)高低不同海拔牦牛腸道菌群結(jié)構(gòu)成分分析

3.2.1 門(mén)水平腸道菌群結(jié)構(gòu)成分分析 牦牛糞便樣本中共有19個(gè)門(mén)的細(xì)菌. 從門(mén)水平對(duì)腸道菌群種12個(gè)樣本的OTU豐度進(jìn)行物種聚類統(tǒng)計(jì)分析顯示，低海拔牦牛前三的菌群以厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)，為主，其平均豐度分別為69.38%、15.37%和7.74%；高海拔牦牛以厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)，其平均豐度分別為73.21%、14.56%和4.06%.

3.2.2 綱水平腸道菌群結(jié)構(gòu)成分分析 牦牛糞便樣本中共有21個(gè)綱的細(xì)菌，如圖1. 從綱水平對(duì)12個(gè)樣本的OUT豐度進(jìn)行物種聚類統(tǒng)計(jì)分析顯示，低海拔牦牛糞便樣本中前三菌群為梭菌綱(Clostridia)擬桿菌綱(Bacteroidia)和以及變形菌綱(Gammaproteobacteria)，其平均豐度分別為64.17%、14.36%和6.12%；高海拔樣本中前三菌群為梭菌綱(Clostridia)、擬桿菌綱(Bacteroidia)和桿菌綱(Bacilli)，其平均豐度分別為13.46%、62.04%和8.12%.

圖1 牦牛腸道菌群在綱水平的分布圖(A)及分布熱度圖(B)Fig.1 The community structure map (A) and the community structure heatmap(B) of samples at the class level in intestinal tract of yaks

3.2.3 目水平腸道菌群結(jié)構(gòu)成分分析 牦牛糞便樣本中共有21個(gè)目的細(xì)菌，如圖2. 從目水平對(duì)不同海拔牦牛腸道菌群種12個(gè)樣本的OTU進(jìn)行物種分類統(tǒng)計(jì)分析顯示，低海拔牦牛糞便樣本中前三菌群分別為梭菌目(Clostridiales)、擬桿菌目(Bacteroidales)和假單胞菌目(Pseudomonadales)，其平均豐度分別為14.36%，平均豐度64.16%和5.72%；高海拔前三菌群分別為梭菌目(Clostridiales)擬桿菌目(Bacteroidales)和芽孢桿菌目(Bacillales)，其平均豐度分別為62.02%、13.46%和8.02%.

圖2 牦牛腸道菌群在目水平的分布(A)及分布熱度圖(B)Fig.2 The community structure map (A)and the community structure heatmap (B) of samples at the order level in intestinal tract of yaks

3.2.4 科水平腸道菌群結(jié)構(gòu)成分分析 牦牛糞便樣本中共有21個(gè)科的細(xì)菌，如圖3. 從科水平對(duì)不同海拔牦牛腸道菌群種12個(gè)樣本的OTU進(jìn)行物種聚類統(tǒng)計(jì)分析顯示，低海拔樣本中前三的菌群分別為瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)和梭菌科(Clostridiaceae)，其平均豐度分別為36.35%， 12.59%和 6.43%；高海拔牦牛糞便樣本中前三的菌群分別為瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)和活動(dòng)性球菌科(Planococcaceae)，其平均豐度分別為29.04%、15.14%和6.64%.

圖3 牦牛腸道菌群在科水平的分布(A)及分布的熱度圖(B)Fig.3 The community structure map (A) and the community structure heatmap(B) of samples at the family level in intestinal tract of yaks

3.2.5 屬水平腸道菌群結(jié)構(gòu)成分分析 牦牛糞便樣本中共有21個(gè)屬的細(xì)菌，如圖4. 從屬水平進(jìn)行物種聚類統(tǒng)計(jì)分析顯示，低海拔牦牛樣本中前三的菌群分別為瘤胃菌屬(Ruminococcaceae_unclassified)、梭菌屬(Clostridium)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)，其平均豐度分別為24.45%、6.30%和5.60%；高海拔樣本中前三的菌群分別為瘤胃菌屬(Ruminococcaceae_unclassified)、活動(dòng)性球菌屬(Planococcaceae_unclassified)和理研菌屬(Rikenella)，其平均豐度分別為20.27%、6.25%和5.53%.

圖4 牦牛腸道菌群在屬水平的分布(A)及分布的熱度圖(B)Fig.4 The community structure map (A)and the community structure heatmap (B) of samples at the genus level in intestinal tract of yaks

從屬水平對(duì)高低海拔牦牛樣本的OTU豐度分析顯示，低海拔牦牛腸道菌群前30菌群豐度總量為83.41%，而高海拔同類菌群豐度總量為58.29%. 低海拔牦牛樣本中前3的菌群分別為瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-005)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-013)和克里斯滕森氏菌群(Christensenellaceae_ R-7_ group). 高海拔樣本中前3的菌群分別為瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-005)，瘤胃解纖維素菌屬(Cellulosilyticum)和 理研菌科胃腸菌群(Rikenellaceae_ RC9_ gut_ group)，數(shù)據(jù)顯示除瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-005)外，高低海拔牦牛腸道菌群屬OTU豐度各不相同，具體見(jiàn)表2.

表2 高、低海拔牦牛腸道菌群Top 30菌群豐度

從屬水平對(duì)前30種菌OTU的豐度分析顯示，高低海拔牦牛的腸道菌群有8個(gè)菌屬的差異比較顯著(P<0.05)，具體為：瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-013，OTU豐度低海拔8.48%，高海拔2.97%)、克里斯滕森氏菌群(Christensenellaceae_ R-7_ group，低海拔6.71%，高海拔3.68%)、氧化還原菌屬([Eubacterium]_oxidoreducens_ group，低海拔5.33%，高海拔1.58%)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-014，低海拔4.63%，高海拔2.50%)、阿克曼菌屬(Akkermansia，低海拔2.27%，高海拔0.59%)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium，低海拔1.96%，高海拔0.49%)、難培養(yǎng)菌屬(uncultured_bacterium_o_Gastranaerophilales，低海拔1.62%，高海拔0.51%)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-002，低海拔1.30%，高海拔0.42%). 低海拔區(qū)域牦牛腸道菌群OTU整體豐度較高海拔高，其中瘤胃球菌和氧化還原菌屬的OTU豐度比高海拔高2倍多.

4 討 論

腸道菌群種類的豐富性和多樣性對(duì)維持腸道微生態(tài)平衡起著重要作用[7]. 而生活在高、低海拔的牦牛腸道菌群的差異目前尚無(wú)報(bào)道. 牦牛正常的腸道菌群在進(jìn)化過(guò)程中與宿主和環(huán)境相互適應(yīng)且成動(dòng)態(tài)平衡，容易受到食物、環(huán)境等因素的影響，加之腸道菌群數(shù)量較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此其研究存在一定難度. 隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使得16s rDNA測(cè)序成為研究腸道菌群的重要工具. 本研究采用16 s RNA高通量測(cè)序首次對(duì)高、低海拔兩種環(huán)境下的牦牛腸道菌群結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)低海拔和高海拔地區(qū)牦牛腸道菌群OTU數(shù)量分別為4 824個(gè)和4 237個(gè)，說(shuō)明低海拔地區(qū)牦牛腸道菌群多樣性較高海拔地區(qū)牦牛腸道菌群多樣性更高，可能是因?yàn)榈秃０蔚貐^(qū)植被更豐富，環(huán)境中細(xì)菌多樣性更高造成的.

在門(mén)水平上，高低海拔牦牛腸道菌群中最多的均為厚壁菌門(mén)(Firmicutes，OTU豐度低海拔69.38%，高海拔73.21%)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，OTU豐度低海拔15.37%，高海拔14.56%)，這一研究與Guo等人(2015)對(duì)牛瘤胃微生物的菌群結(jié)構(gòu)研究結(jié)果相似[8].

本研究顯示高低海拔牦牛腸道菌群存在較大差異，其中瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-013)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-014)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_ UCG-002)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae_ R-7_ group)、氧化還原菌屬([Eubacterium]_oxidoreducens_ group)、阿克曼菌屬(Akkermansia)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、難培養(yǎng)菌屬(uncultured_bacterium_o_Gastranaerophilales)等差異顯著，低海拔地區(qū)牦牛腸道菌群中瘤胃球菌屬和氧化還原菌屬的OTU豐度比高海拔高2倍多. 瘤胃球菌是反芻動(dòng)物胃中嚴(yán)格厭氧不運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陽(yáng)性菌，主要含白色瘤胃球菌和生黃瘤胃球菌兩類，廣泛分布于牦牛的瘤胃中[9]，是牦牛腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群，與牦牛消化功能有著密切的關(guān)系. 研究證實(shí)，瘤胃球菌產(chǎn)生的纖維素酶能夠吸附并降解植物細(xì)胞壁，有效提高牦牛消化高纖維植物的能力[10]. 本研究發(fā)現(xiàn)高海拔地區(qū)牦牛的腸道菌群中，瘤胃球菌豐度顯著低于低海拔地區(qū)牦牛. 若高海拔地區(qū)的牦牛向低海拔地區(qū)遷徙時(shí)，由于高海拔地區(qū)牦牛腸道內(nèi)瘤胃球菌等優(yōu)勢(shì)菌的豐度較低，高海拔地區(qū)牦牛腸道微生態(tài)短時(shí)間內(nèi)無(wú)法適應(yīng)低海拔的環(huán)境條件，可能導(dǎo)致牦牛對(duì)纖維素的消化不良，進(jìn)而引起牦牛腹瀉. 這與Han等人發(fā)現(xiàn)的腹瀉的牦牛腸道菌群中瘤胃球菌明顯下降一致[11]. 事實(shí)證明，當(dāng)高海拔地區(qū)的牦牛向低海拔地區(qū)引進(jìn)時(shí)，牦牛常常會(huì)出現(xiàn)腹瀉的現(xiàn)象，可能與不同海拔地區(qū)牦牛腸道菌群結(jié)構(gòu)組成差異有關(guān)，其具體原因及機(jī)制還需進(jìn)一步研究.

我國(guó)2008年批準(zhǔn)了16種微生物添加劑，乳酸菌、芽孢桿菌、酵母、雙歧桿菌、腸球菌、鏈球菌等均是名錄上微生物添加劑中的菌種，這些益生菌對(duì)維護(hù)動(dòng)物腸道健康、緩解不良應(yīng)激反應(yīng)、改善畜舍環(huán)境、調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪代謝、替代抗生素和改善畜產(chǎn)品品質(zhì)有著重要的作用[12]. 在高海拔地區(qū)的牦牛向低海拔地區(qū)引進(jìn)時(shí)，在牦牛的日糧中補(bǔ)充益生菌，是否有助于牦牛盡快適應(yīng)低海拔地區(qū)環(huán)境需進(jìn)一步研究. 另外，不同海拔地區(qū)牦牛的交流，可能有助于提升某一區(qū)域牦牛腸道菌群多樣性，本研究表明了高、低海拔牦牛腸道菌群結(jié)構(gòu)存在較大的差異，為高海拔地區(qū)的牦牛向低海拔遷徙提供了微生態(tài)結(jié)構(gòu)的參照，有利于牦牛飼養(yǎng)業(yè)、畜牧業(yè)探索不同海拔區(qū)域間牦牛的物種交流.