郭世英

（東北林業(yè)大學生命科學學院 東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

聚乙烯亞胺（Polyethyleneimine, PEI）是一類陽離子聚合物，能夠幫助目的基因實現(xiàn)內體逃逸，提高轉染效率。然而，PEI 也具有較大的細胞毒性。研究表明PEI 通過修飾后可提高其基因轉染效果并降低對轉染細胞的毒性[1]。

氟元素電負性大，氟修飾的化合物常具有疏水疏油的性質[2]，本研究使用五氟丙酸酐對PEI 進行修飾，以提高其與細胞膜的親和力，增加轉染效率。同時，氟修飾可降低PEI 的細胞毒性，改善細胞攝取、內體逃逸和細胞內DNA 釋放過程。此外，由于氟化聚合物低表面能，在低濃度時傾向于相互結合，因此氟修飾后的PEI（PEIF）在較低氮磷比時便能與核酸形成復合物。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

PEI（MW:1.8kDa ），五氟丙酸酐，pCMV-GFP 質粒，PC3 細胞系，Brookhaven PALS/90P Zeta PALS 電位粒度分析儀、凝膠電泳裝置，熒光顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 PEIF 的制備及表征

將1 mmol PEI 和3.6 mmol 三乙胺溶解于20mL 無水甲醇中，后緩慢滴加到含3 mmol 五氟丙酸酐的10 mL 無水甲醇中，室溫下攪拌72 h 后旋轉蒸發(fā)除去溶劑，用去離子水復溶后裝入500 Da 的透析袋中透析48 h，之后凍干得到PEIF。用核磁共振氟譜對其結構進行表征。

1.2.2 PEI/pCMV-GFP、PEIF/pCMV-GFP 復合物的制備及表征

將5μg 質粒溶于1.8 mL 超純水中，加入200μL 的PEI 溶液（1mg/mL），混勻后室溫靜置30min 得到PEIF/pCMV-GFP 復合體。室溫下測定復合物的粒徑和電位。PEIF/pCMV-GFP 復合物通過相同的方法制備。

1.2.3 凝膠阻滯實驗

將1μg質粒與不同濃度PEIF 溶液混勻，室溫孵育30min。以質粒DNA為對照，點樣到1.0%的瓊脂糖凝膠中，120V下電泳30min 后采集圖像。

1.2.4 PEI、PEIF 轉染PC3 細胞

PC3 細胞匯合度達到80%時吸去舊培養(yǎng)基，加入150μL 無血清培養(yǎng)基和50μL 的DNA/PEI復合物。DNA/PEI 復合物制備過程：將1μg 質粒加入無血清培養(yǎng)基中，再加入PEI，室溫孵育30min 后，將DNA/PEI 復合物加入細胞孔板中，輕輕混勻。

2 結果與討論

2.1 PEIF 的構建與表征結果

用五氟丙酸酐與1.8 kDa PEI 反應合成PEIF。PEI 與氟代丙酸酐的質量比為1:6、1:3、1:1.5，產物表示為PEIF（1:6）、PEIF（1:3）、PEIF（1:1.5）。圖2 所示，通過PEI 與五氟丙酸酐的反應合成了含酰胺鍵的PEIF，酰胺鍵的出現(xiàn)表明PEIF 復合物的成功構建。

圖1 PEIF 載體構建

圖2 PEIF 的核磁共振氟譜圖

2.2 pCMV-GFP/PEI、pCMV-GFP/PEIF 復合物構建及表征

的結果分析

對復合物粒徑和電位進行表征，并得到了相應的結果（表1）。復合物在最佳質量比例下帶正電荷，所有PEIF 都能將DNA濃縮成100nm 以內的納米粒子。

表1 不同質量比的DNA/PEIF 粒徑、電位、分散系數(shù)

2.3 凝膠阻滯實驗的結果分析

利用凝膠電泳研究了PEIF 的DNA 濃縮能力。圖3 所示，PEIF 具有較好的DNA 結合能力，在相對較低的質量比下有效阻礙DNA 遷移。結果顯示，pCMV-GFP/PEI 的質量比為4:1 時完全阻滯；DNA/PEIF（1:6）質量比在1:2 時完全阻滯；DNA/PEIF（1:3）質量比在4:1 時完全阻滯；DNA/PEIF（1:1.5）質量比在8:1 時完全阻滯。

圖3 凝膠阻滯結果

2.4 PEI、PEIF 的DNA 轉染效率

利用GFP 為報告基因，在PC3 細胞中檢測PEI 和PEIF 的DNA 轉 染 效 果，Lipo 3000 為 對照。圖4 為不同質量比PEIF 轉染細胞后GFP 的表達情況。與Lipo3000 相比，PEI、PEIF 的細胞毒性顯著低于Lipo3000。單純PEI 表現(xiàn)出極低的GFP 轉染效果，而PEIF 轉染效果顯著提高，說明氟修飾可顯著增強PEI 轉染效率。此外，PEIF 以較低的質量比率獲得最佳的轉染。PEIF（1:6）、PEIF（1:3）、PEIF（1:1.5）的轉染效率依次增加；DNA/PEIF（1:6）質量比在1:8、1:10 開始有轉染效果；質量比1:14、1:16、1:18、1:20 的DNA/PEIF（1:3）轉染效率較高；質量比1:10、1:12、1:14、1:16、1:18、1:20 的DNA/PEIF（1:1.5）轉染效率較高。在所有PEIF 中，PEIF（1:1.5）轉染PC3 細胞的效率最高，這是由于PEI 表面接枝過量的氟鏈會降低樹枝狀分子的表面電荷密度，從而阻止穩(wěn)定聚合物/DNA 復合物的形成。轉染48h 的結果顯示，PEIF（1:1.5）與質粒的質量比為1:20 時，其轉染效率高于Lipo3000。

圖4 PEI、PEIF 轉染PC3 細胞48h

3 結論

PEI 經氟修飾后形成的PEIF 轉染效率顯著增加，氟修飾的PEIF 能夠降低細胞毒性，保持較高的轉染效率。本研究設計了不同的氟修飾比例以及質粒DNA 與氟化PEI 的質量比，通過凝膠阻滯和轉染實驗探究最適轉染效率對應的比例，篩選獲得比轉染試劑Lipo3000 毒性更低且轉染效率更高的PEIF，研究發(fā)現(xiàn)，質量比為1：20 的氟化PEI（1:1.5）可實現(xiàn)質粒載體在PC-3 細胞中的高效表達，這為改良高效的質粒遞送轉染試劑提供了新思路。