龔 亞，李 敏，曹 健，樊 莉 （陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400037）

對(duì)照品系指國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中用于鑒別、檢查、含量測(cè)定、雜質(zhì)和有關(guān)物質(zhì)檢查等的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[1]?！吨袊?guó)藥典》中并沒有明確規(guī)定對(duì)照品溶液的存放有效期，但《中國(guó)藥典》和《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP）均要求使用單位應(yīng)對(duì)對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性和使用效期進(jìn)行驗(yàn)證，通過研究結(jié)果來(lái)確定內(nèi)控效期[1-7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合日常檢驗(yàn)工作的使用率、制劑中間品和成品抽檢的周期，挑選5種制劑（維生素E珍珠乳膏、新面醑、復(fù)方替硝唑溶液、磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑和地塞米松磷酸鈉滴鼻液），涉及8種常用的對(duì)照品（維生素E、甲硝唑、氯霉素、水楊酸、替硝唑、醋酸氯己定、磺胺嘧啶和地塞米松磷酸酯），按照相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定[8-14]，考察各對(duì)照品儲(chǔ)備液在2～10 ℃冰箱中的穩(wěn)定性，為存放效期提供必要依據(jù)，從而規(guī)定對(duì)照品儲(chǔ)存的內(nèi)控時(shí)間[15-18]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1 260 型高效液相色譜儀（包括脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、G7114A紫外檢測(cè)器、Chemstation工作站，美國(guó)Agilent公司）；Agilent 1200 型高效液相色譜儀（包括脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、G1314B紫外檢測(cè)器、Chemstation工作站，美國(guó)Agilent公司）；PHS-3C型精密 pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；ME235S電子天平（德國(guó)賽多利斯）；EX225DZH電子天平（美國(guó)奧豪斯）。

1.2 試藥

對(duì)照品維生素E（批號(hào)10062-0007，純度99.2%）、甲硝唑（批號(hào)100191-201808，純度100.0%）、氯霉素（批號(hào)130555-201203，純度99.8%）、水楊酸（批號(hào)100106-201104，純度99.9%）、替硝唑（批號(hào)100336-201704，純度100.0%）、醋酸氯己定（批號(hào)100183-201003，純度96.2%）、磺胺嘧啶（批號(hào)100026-201404，純度99.7%）、地塞米松磷酸酯（批號(hào)101116-201102，純度98.6%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純（霍尼韋爾，美國(guó)）；磷酸、磷酸二氫鉀、鹽酸、醋酸銨、三乙胺為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 維生素E珍珠乳膏（維生素E）色譜條件[8-9]

色譜柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇，流速為1.5 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm，進(jìn)樣量為10 μl。

2.1.2 新面醑（甲硝唑、氯霉素、水楊酸）色譜條件[10-11]

色譜柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.04%磷酸溶液（V∶V=47∶53），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm，進(jìn)樣量為10 μl。

2.1.3 復(fù)方替硝唑溶液（替硝唑、醋酸氯己定）色譜條件[12]

色譜柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇為流動(dòng)相A，以甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH3.5）（V∶V=20∶80）為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～8 min，0%～55% A；8～15 min，55% A；15～15. 1 min，55%～0% A；15. 1～20 min，0% A)，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，進(jìn)樣量為10 μl。

2.1.4 磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑（磺胺嘧啶）色譜條件[13]

色譜柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.3%醋酸銨溶液（V∶V=20∶80），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，進(jìn)樣量為10 μl。

2.1.5 地塞米松磷酸鈉滴鼻液（地塞米松）色譜條件[14]

色譜柱：Hypersil BDS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.75%三乙胺溶液（磷酸調(diào)pH 至3.0）-甲醇-乙腈（V∶V∶V= 55∶40∶5），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為242 nm，進(jìn)樣量為10 μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

2.2.1 維生素E對(duì)照品溶液

精密稱取維生素E對(duì)照品約10 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml中約含維生素E 0.2 mg的對(duì)照品溶液。

2.2.2 甲硝唑、氯霉素、水楊酸混合對(duì)照品溶液

精密稱取甲硝唑、氯霉素對(duì)照品各約10 mg，分別置10 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；另精密稱取水楊酸對(duì)照品約12.5 mg，置100 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述甲硝唑、氯霉素對(duì)照品稀釋液各5 ml、水楊酸對(duì)照品稀釋液10 ml，置于同一25 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml中約含甲硝唑、氯霉素和水楊酸分別為0.2 mg、0.2 mg和0.05 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 替硝唑、醋酸氯己定混合對(duì)照品溶液

精密稱取替硝唑?qū)φ掌芳s10 mg、醋酸氯己定對(duì)照品約10 mg置于同一50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋成每1 ml中約含替硝唑、醋酸氯己定各0.2 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.4 磺胺嘧啶對(duì)照品溶液

精密稱取磺胺嘧啶對(duì)照品約12.5 mg，置25 ml量瓶中，加稀鹽酸1 ml溶解后，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml中約含磺胺嘧啶0.1 mg的對(duì)照品溶液。

2.2.5 地塞米松磷酸酯對(duì)照品溶液

精密稱取地塞米松磷酸酯對(duì)照品約15 mg，置50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取稀釋液3 ml，置25 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml 約含地塞米松磷酸酯0.036 mg的溶液。

上述對(duì)照品溶液均置于具塞的量瓶中，且用封口膜封口，取用后立即冷藏（2～10 ℃）保存，分析前需放至室溫。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖1。各色譜條件下，各主成分峰分離度均大于1.5，理論板數(shù)滿足相應(yīng)制劑標(biāo)準(zhǔn)要求，且各出峰情況與文獻(xiàn)一致[8-14]。

圖1 系統(tǒng)適用性高效液相色譜圖

2.4 對(duì)照品溶液穩(wěn)定性考察

2.4.1 試驗(yàn)方法[15-24]

將上述3種對(duì)照品溶液在保存0、1、4、7、10、14、21、28、35 d時(shí)，與當(dāng)天新鮮配制的相應(yīng)對(duì)照品溶液按照相應(yīng)色譜條件分別進(jìn)樣，分別計(jì)算平均峰面積，以當(dāng)天新鮮配制的對(duì)照品溶液計(jì)算對(duì)照品儲(chǔ)存溶液的含量值。

2.4.2 結(jié)果計(jì)算[2,20-23]

每個(gè)測(cè)試時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果都是用新鮮配制的對(duì)照品溶液的平均響應(yīng)值，來(lái)重新計(jì)算用于研究效期的對(duì)照品溶液的標(biāo)示量，基于下述公式進(jìn)行計(jì)算：

式中，AN和CN表示新鮮配制對(duì)照品的峰面積和濃度；AT和CT表示對(duì)照品儲(chǔ)存溶液的峰面積和濃度。

2.4.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)[2]

各對(duì)照品溶液均未出現(xiàn)渾濁、沉淀等異?，F(xiàn)象；測(cè)試用對(duì)照品溶液與新鮮配制的對(duì)照品溶液外觀一致；色譜圖中均未出現(xiàn)顯著的雜質(zhì)峰；每個(gè)分析測(cè)試點(diǎn)，要求對(duì)照品儲(chǔ)存溶液的標(biāo)示量與零點(diǎn)的差異不得超過2.0%。

2.4.4 結(jié)果

上述各類對(duì)照品溶液在2～10 ℃冰箱內(nèi)密封儲(chǔ)存35 d，測(cè)試用對(duì)照品溶液外觀與新配制對(duì)照品溶液一致，未出現(xiàn)渾濁、沉淀等現(xiàn)象；色譜中均未出現(xiàn)顯著的雜質(zhì)峰，每個(gè)分析測(cè)試點(diǎn)，對(duì)照品溶液的含量變化如圖2所示，維生素E儲(chǔ)存35 d、甲硝唑、氯霉素和水楊酸混合對(duì)照品儲(chǔ)存7 d、替硝唑和醋酸氯己定混合對(duì)照品儲(chǔ)存35 d、磺胺嘧啶儲(chǔ)存35 d、地塞米松磷酸酯儲(chǔ)存35 d，含量符合要求。結(jié)合含量標(biāo)準(zhǔn)要求，在2～10 ℃冰箱中，維生素E對(duì)照品、替硝唑和醋酸氯己定混合對(duì)照品、磺胺嘧啶對(duì)照品、地塞米松磷酸酯對(duì)照品溶液的效期可定為35 d，甲硝唑、氯霉素和水楊酸混合對(duì)照品溶液定為7 d。

圖2 5種制劑中8種對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性

3 討論

對(duì)照品溶液是藥品檢驗(yàn)的重要部分，對(duì)照品儲(chǔ)存在冰箱中需要以封口膜封口，減少溶劑的揮發(fā)；從冰箱中取出時(shí)，需超聲半分鐘或放至室溫，搖勻后再取下封口膜取樣，避免直接打開引起瓶?jī)?nèi)揮發(fā)的溶劑流失，影響測(cè)定結(jié)果。

考察結(jié)果中發(fā)現(xiàn)甲硝唑、氯霉素和水楊酸混合對(duì)照品溶液穩(wěn)定性較差，各組分儲(chǔ)存期分別為35、21和7 d。采用三組分單獨(dú)配制儲(chǔ)存進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲硝唑、氯霉素、水楊酸溶液的儲(chǔ)存時(shí)間分別為35、35和10 d，同比混合對(duì)照品溶液中，氯霉素穩(wěn)定性增加，但對(duì)水楊酸穩(wěn)定性改善不明顯，因此推測(cè)氯霉素的不穩(wěn)定性是受其他成分的影響，水楊酸的不穩(wěn)定性是其固有屬性。

通過對(duì)照品儲(chǔ)存溶液穩(wěn)定性的考察，可為實(shí)驗(yàn)室對(duì)照品溶液內(nèi)控管理提供數(shù)據(jù)參考，有助于減少對(duì)照品的損耗，節(jié)約藥品檢驗(yàn)成本[2,19]。對(duì)于某些說(shuō)明書中附有“本品具有引濕性，建議打開包裝后一次使用完畢”的對(duì)照品，可于首次打開后精密稱定多份置于適宜的容量瓶?jī)?nèi)備用，從而降低檢驗(yàn)成本，如中國(guó)食品藥品檢定研究院在售對(duì)照品地塞米松磷酸酯[25]為200 mg/支（單價(jià)為390元），即可采用首次開封后，按需求單劑量分裝的方式儲(chǔ)存。

實(shí)際生產(chǎn)過程中，環(huán)節(jié)多而繁瑣，常常中間品和成品抽檢時(shí)間跨度長(zhǎng)，增加了對(duì)照品的消耗?！吨袊?guó)藥典》四部[1]規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液應(yīng)臨用前配制，否則應(yīng)證明其適用性。各類制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的過程中，一般考察為對(duì)照品室溫和4 ℃條件下24 h內(nèi)的穩(wěn)定性，這個(gè)時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足中間品和成品的時(shí)間跨度。文中對(duì)5種制劑涉及的8種對(duì)照品儲(chǔ)存液適用性進(jìn)行考察，驗(yàn)證其穩(wěn)定性，為內(nèi)控效期的制定提供了依據(jù)，基本能夠保證對(duì)照品儲(chǔ)備液的效期能夠涵蓋中間品和成品檢驗(yàn)時(shí)間的跨度，完成一批檢品的檢驗(yàn)。