劉曉玲，楊育儒，蔡小輝，陳錦珊 （中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第909醫(yī)院/廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院藥劑科，福建漳州 363000）

鐮形棘豆（Oxytropis falcateBunge）系豆科棘豆屬多年生無(wú)莖草本植物。據(jù)《晶珠本草》記載，鐮形棘豆以根及根莖或全草入藥，被譽(yù)為“草藥之王”，是我國(guó)青藏高原常用的民間草藥之一[1]。研究表明鐮形棘豆主要活性成分有黃酮類、生物堿類、多糖類等[2]，其中黃酮類具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抑菌等生物活性，在抗腫瘤、抗2型糖尿病及防紫外線曬傷等領(lǐng)域已有較多的文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]。因此，尋找適宜的鐮形棘豆總黃酮含量測(cè)定方法對(duì)其進(jìn)一步研究具有重要意義。

目前，中藥中黃酮含量測(cè)定的常用方法有高效液相色譜法[5-6]、毛細(xì)管電泳法[7]和紫外可見分光光度法[8-13]。其中前兩種方法用于測(cè)定黃酮單體，而紫外分光光度法則用于測(cè)定總黃酮。近年來(lái)，金屬離子絡(luò)合法[8-13]已成為總黃酮含量測(cè)定應(yīng)用最廣泛的方法[10]，其原理是在酸性或堿性條件下，金屬離子與黃酮發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成不同顏色的金屬螯合物，再在紫外或可見光區(qū)用比色法測(cè)定其含量[10]，常用的顯色劑有氯化鋁和硝酸鋁。鐮形棘豆總黃酮含量測(cè)定方法研究未見報(bào)道，本文以蘆丁為對(duì)照品，對(duì)氯化鋁顯色法和硝酸鋁顯色法直接測(cè)定總黃酮進(jìn)行考察，以期建立適用于鐮形棘豆總黃酮的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AUX220電子分析天平、2550紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）；LD5-2A低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；HH2數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市江南儀器廠）；SY-176華美冷柜（杭州華美電冰箱廠）。

1.2 試藥

鐮形棘豆（青海西寧，經(jīng)聯(lián)勤保障部隊(duì)第909醫(yī)院鄭紹忠副主任藥師鑒定為豆科棘豆屬植物鐮形棘豆）；蘆丁對(duì)照品（純度92.6%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-200707）；95%乙醇、氫氧化鈉、醋酸鈉、氯化鋁、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鐮形棘豆總黃酮的提取及純化[14-15]

精密稱取適量鐮形棘豆粗粉，置圓底燒瓶中，加入20倍量66%乙醇回流提取2次，每次84 min，過濾，合并濾液，即為上樣液。以D-101大孔樹脂上柱，上樣濃度為275 mg/g，洗脫劑為80%乙醇，洗脫液減壓濃縮真空干燥，得純度為62.86%的總黃酮粉末。

2.2 蘆丁對(duì)照品溶液配制

精確稱取蘆丁對(duì)照品0.011 0 g，置于50 ml量瓶中，60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.22 mg/ml的蘆丁對(duì)照品溶液，備用。

2.3 儲(chǔ)備液和供試品溶液配制

精確稱取鐮形棘豆總黃酮粉末0.087 5 g，置于25 ml量瓶中，60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為3.50 mg/ml的儲(chǔ)備液。精密吸取1 ml儲(chǔ)備液至10 ml量瓶中，用60%乙醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液，備用。

2.4 顯色系統(tǒng)的選擇

2.4.1 最大吸收波長(zhǎng)一致性的考察

直接測(cè)定法：分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液1.0 ml，置于25 ml量瓶中，用60%乙醇稀釋并定容至刻度，搖勻。以60%乙醇為空白，于200～800 nm掃描，記錄最大吸收波長(zhǎng)。

AlCl3顯色法：分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液1.0 ml置于25 ml量瓶中，加入0.1mol/L三氯化鋁溶液3.0 ml，再加入1.0 mol/L醋酸鈉5.0 ml，用60%乙醇稀釋并定容至25 ml，搖勻，放置5 min。以60%乙醇為空白，于200～800 nm處掃描，記錄最大吸收波長(zhǎng)。

Al(NO3)3顯色法：分別吸取對(duì)照品和供試品溶液1.0 ml于25 ml容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1 ml,搖勻放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻放置6 min，繼續(xù)加入4%氫氧化鈉溶液10 ml，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。以60%乙醇為空白，于200～800 nm處掃描，記錄最大吸收波長(zhǎng)。

結(jié)果由圖1可知，直接測(cè)定法的對(duì)照品與供試品最大吸收波長(zhǎng)不一致，而氯化鋁顯色法和硝酸鋁顯色法對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)接近，分別為277 nm和356 nm。筆者進(jìn)一步研究供試品和顯色劑對(duì)氯化鋁顯色法和硝酸鋁顯色法的影響，以優(yōu)選出鐮形棘豆總黃酮最適顯色系統(tǒng)。

圖1 鐮形棘豆總黃酮測(cè)定方法的比較

2.4.2 供試品和顯色劑對(duì)反應(yīng)體系干擾的考察

AlCl3顯色法：分別吸取供試品溶液1.0 ml于25ml量瓶中，加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液3.0 ml，再加入1.0 mol/L醋酸鈉5.0 ml，用60%乙醇稀釋并定容至25 ml，搖勻，放置5 min。分別以60%乙醇、供試品和顯色劑為空白，于200～800 nm處掃描，記錄圖譜。

Al(NO3)3顯色法：分別吸取供試品溶液1.0 ml于25 ml容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1ml,搖勻放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1ml，搖勻放置6 min，繼續(xù)加入4%氫氧化鈉溶液10 ml，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。分別以60%乙醇、供試品和顯色劑為空白，于200～800 nm處掃描，記錄圖譜。

結(jié)果如圖2所示。由圖2A可知，在AlCl3顯色體系中，以供試品作為空白時(shí)，其吸光度值相較于以60%乙醇作為空白時(shí)下降，表明供試品本身對(duì)AlCl3顯色體系的信號(hào)是存在干擾的；以顯色劑作為空白時(shí)，其吸光度值相較于以60%乙醇作為空白時(shí)保持不變，表明顯色劑對(duì)AlCl3顯色體系的信號(hào)不存在干擾。由圖2B可知，在Al(NO3)3顯色體系中，以供試品和顯色劑作為空白時(shí)，其吸光度值相較于以60%乙醇作為空白時(shí)均有所下降，表明供試品和顯色劑對(duì)Al(NO3)3顯色體系的信號(hào)均存在干擾。

圖2 反應(yīng)體系干擾因素考察圖譜

考慮到干擾因素的可去除性，Al(NO3)3顯色體系顯然不適合鐮形棘豆總黃酮的測(cè)定，因?yàn)槠湫盘?hào)干擾因素供試品和顯色劑無(wú)法同時(shí)去除。而AlCl3顯色體系則可通過以供試液不加顯色劑作為空白來(lái)去除信號(hào)干擾，因此選擇AlCl3顯色體系用于鐮形棘豆總黃酮含量的測(cè)定，并進(jìn)行顯色條件優(yōu)化。

2.5 顯色條件的優(yōu)化及最優(yōu)顯色條件確定

精密量取供試品溶液1.0 ml，置25 ml量瓶中，按照“2.4.1”項(xiàng)下方法，依次考察三氯化鋁濃度（0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 mol/L）、醋酸鈉濃度（0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L）、氯化鋁用量（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml）、醋酸鈉用量（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 ml）及反應(yīng)時(shí)間（0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 min），試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)氯化鋁濃度為0.3 mol/L，用量為3.0 ml，醋酸鈉濃度為1.0 mol/L，用量為4.0 ml，反應(yīng)時(shí)間為16 min時(shí)，供試品吸光度值最大且趨于穩(wěn)定。

分別取供試液和對(duì)照品溶液1 ml于25 ml量瓶中，加入0.3 mol/L三氯化鋁溶液3.0 ml，再加入1.0 mol/L醋酸鈉4.0 ml，用60%乙醇稀釋并定容至25 ml，搖勻，放置16 min，以供試液不加顯色劑為參比，于200～800 nm處掃描，記錄最大吸收波長(zhǎng)，結(jié)果見圖3。

圖3 最優(yōu)顯色條件圖譜

2.6 線性與回歸方程

精密量取蘆丁對(duì)照溶液（0.22 mg/ml）1、1.5、2、3、4、5 ml，分別置于25 ml量瓶中，按“2.5”項(xiàng)下顯色條件，制備系列濃度對(duì)照品溶液，以供試液不加顯色劑為參比，在277 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蘆丁對(duì)照品濃度X（μg/ml）為橫坐標(biāo)、吸光度Y（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得回歸方程為Y=0.035 3X+0.026 7（r=0.999 6），表明在8.8～44.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)，蘆丁對(duì)照品濃度與吸光度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密量取按“2.2”項(xiàng)下制備的蘆丁對(duì)照品溶液1.0 ml，6份，置于25 ml量瓶中，按“2.5”項(xiàng)下顯色條件，在277 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度計(jì)算RSD為0.15%（n=6），結(jié)果表明精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取按“2.3”項(xiàng)下制備的鐮形棘豆總黃酮供試品溶液1.0 ml，6份，置于25 ml量瓶中，按“2.5”項(xiàng)下顯色條件，在277 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度計(jì)算RSD為1.97%（n=6），表明本法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取按“2.3”項(xiàng)下制備的鐮形棘豆總黃酮供試品溶液1.0 ml，置于25 ml量瓶中，按“2.5”項(xiàng)下顯色條件，每隔10 min測(cè)定一次，在277 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度計(jì)算RSD為1.2%（n=6），表明樣品在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取按“2.3”項(xiàng)下制備的鐮形棘豆總黃酮供試品溶液1.0 ml，置于25 ml量瓶中，再分別加入蘆丁對(duì)照品溶液（0.242 mg/ml）0.65、1.00和1.10 ml，每個(gè)體積3份，共9份，按“2.5”項(xiàng)下顯色條件，在277 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算總黃酮含量，并計(jì)算得回收率平均值為100.91%，RSD為2.426%（n=9），結(jié)果見表1。

表1 鐮形棘豆總黃酮加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.11 鐮形棘豆總黃酮含量測(cè)定

按“2.3”項(xiàng)下方法制備鐮形棘豆總黃酮供試品溶液3批，按“2.5”項(xiàng)下顯色條件，于277 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以測(cè)得的吸光度結(jié)果計(jì)算RSD為3.30%（n=9），結(jié)果見表2。

表2 鐮形棘豆總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

黃酮類化合物是一類廣泛存在于中草藥中的化合物，是植物的重要次生代謝產(chǎn)物。黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)交叉共軛體系，即A環(huán)苯甲?；到y(tǒng)和B環(huán)桂皮酰基系統(tǒng)，產(chǎn)生兩個(gè)紫外吸收譜帶，分別在240～280 nm（Ⅰ）處和300～400 nm（Ⅱ）處。此類化合物的苯環(huán)上多有酚羥基取代，因此在堿性條件下，兩個(gè)紫外吸收譜帶可發(fā)生紅移。利用這一光譜性質(zhì)可采用紫外分光光度法進(jìn)行黃酮類化合物含量測(cè)定。其中，Al(NO3)3顯色法原理為用亞硝酸鈉先把還原酮還原，再加Al3+進(jìn)行絡(luò)合，最后在NaOH堿性條件下使黃酮C環(huán)裂解生成查爾酮而顯示橙紅色。AlCl3顯色法原理為Al3+可與黃酮的3-羥基-4-羰基、5-羥基-4-羰基和B環(huán)鄰二酚羥基絡(luò)合[16]，使黃酮的紫外吸收譜帶紅移再用該法測(cè)定。

不同中藥的總黃酮化合物組分各不相同，其顯色方法需要經(jīng)過研究及驗(yàn)證?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[17-19]，單純以顯色劑或供試品作為空白，其干擾因素的影響較為復(fù)雜。本文在顯色方法選擇時(shí)發(fā)現(xiàn)供試品和顯色劑對(duì)Al(NO3)3顯色體系在356 nm處的信號(hào)均存在干擾，其干擾因素?zé)o法去除，并且其專屬性較差，存在多個(gè)小峰。而AlCl3顯色體系中，供試品本身對(duì)AlCl3顯色體系在277 nm處的信號(hào)存在干擾，但顯色劑對(duì)AlCl3顯色體系的信號(hào)不存在干擾，因此，可通過以供試液不加顯色劑作為空白來(lái)去除信號(hào)干擾。

通過AlCl3顯色法的顯色條件優(yōu)化，最佳顯色條件為0.3 mol/L三氯化鋁溶液3.0 ml，1.0 mol/L醋酸鈉4.0 ml，放置16 min，最大吸收波長(zhǎng)為277 nm。經(jīng)方法學(xué)考察，該方法用于鐮形棘豆總黃酮含量測(cè)定，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確和靈敏等優(yōu)點(diǎn)。