石好琪，吳則東，興旺，丁劉慧子，邳植

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜（Beta vulgarisL.）為藜科甜菜屬的二年生草本植物[1]，其產(chǎn)糖占據(jù)了世界蔗糖供應(yīng)量的20%左右[2]，是除甘蔗以外的第二大糖料來源。因?yàn)樘鸩耸菬o限花序作物，所以人工去雄這種途徑不可取[3]。甜菜要想利用雜種優(yōu)勢(shì)，不育系和保持系的利用是必不可少的，這就使得對(duì)甜菜的雄性不育系和保持系快速鑒定和選育顯得尤為重要。選育甜菜優(yōu)良品種就必須有優(yōu)良不育系和授粉系，而選育甜菜不育系是甜菜育種中技術(shù)含量最高的環(huán)節(jié)之一。選育不育系的關(guān)鍵在于選育相應(yīng)的保持系。選育甜菜保持系的方法目前主要為鑒定法。鑒定法是利用已有的不育系與待鑒定的個(gè)體進(jìn)行成對(duì)雜交，而后觀察后代育性情況，若全為不育系則待測個(gè)體即為保持系。程大友等人[4]利用鑒定法用時(shí)15個(gè)月左右成功鑒定出了甜菜保持系。雖然鑒定法鑒定甜菜保持系耗時(shí)相對(duì)較短，而分子標(biāo)記鑒定甜菜育性具有更加省時(shí)、方便快捷的優(yōu)點(diǎn)。如HAGIHARA 等[5]利用兩個(gè)RAPD標(biāo)記很好地區(qū)分出來甜菜不育和完全可育株。孟祥雯[6]依據(jù)甜菜葉片DNA 及花蕾cDNA多態(tài)性，得到甜菜‘DY5’品系保持系和不育系基因組、轉(zhuǎn)錄組并分析其差異。劉一珺[7]根據(jù)設(shè)計(jì)出的29對(duì)引物進(jìn)行篩選得出7對(duì)引物所在甜菜不育系和保持系之間具有差異，至于這7對(duì)引物在其它甜菜品系的不育系和保持系中是否同樣適用需要進(jìn)一步驗(yàn)證。趙麗梅等人[8]利用412 對(duì)SSR 引物對(duì)大豆RN 型不育系‘YA’和恢復(fù)系‘167’雜交的F2分離群體進(jìn)行篩選，獲得了Satt414、Satt596 和Satt547 分子標(biāo)記，通過這些分子標(biāo)記可以提高大豆恢復(fù)系選育速度和效率，并且可為進(jìn)一步精準(zhǔn)定位恢復(fù)基因和克隆恢復(fù)基因打下基礎(chǔ)。李志寬等人[9]通過對(duì)小麥的196對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增篩選，得出7個(gè)SSR分子標(biāo)記在‘矮抗58’和‘R113’的F2代分離群體中的極端可育株和極端不育株的恢復(fù)池與不育池中擴(kuò)增出了穩(wěn)定的多態(tài)性差異條帶，這7 個(gè)SSR 標(biāo)記可直接用于T型或者S 型雜交小麥分子標(biāo)記輔助育種，能有效提高相應(yīng)恢復(fù)系的選擇效率。趙麗梅等人[8]和李志寬等人[9]利用SSR分子標(biāo)記對(duì)大豆、小麥的恢復(fù)系輔助選育研究，為我們應(yīng)用SSR分子標(biāo)記在甜菜不育系和保持系的鑒定提供了新思路。

大量可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列（Variable Number of Tandem Repeats，VNTR）存在于真核生物基因組中[10]，這些序列與多個(gè)基因座雜交并且本質(zhì)上是可變的，因此被證明對(duì)遺傳分析非常有用[11-12]。甜菜線粒體基因組中有4 個(gè)不相關(guān)聯(lián)的串聯(lián)重復(fù)位點(diǎn)（TR1、TR2、TR3 和TR4），而其中TR1 串聯(lián)重復(fù)序列的多態(tài)性最高，拷貝數(shù)從2～13 個(gè)不等?？梢岳米饔糜谔鸩司€粒體VNTR 位點(diǎn)的細(xì)胞質(zhì)鑒定引物TR1 進(jìn)行甜菜細(xì)胞質(zhì)類型鑒定[13]，再利用甜菜細(xì)胞核DNA 的bvORF17上游區(qū)的多態(tài)性鑒定細(xì)胞核育性恢復(fù)基因（Rf1）的基因型就可以快速了解甜菜的育性組成情況[14]。本研究通過分子標(biāo)記的手段了解國家甜菜種質(zhì)資源庫中甜菜多胚種質(zhì)資源的細(xì)胞質(zhì)類型以及細(xì)胞核育性恢復(fù)基因組成情況，為將來應(yīng)用多胚保持系同步改良單胚不育系和保持系以及應(yīng)用多胚保持系做父本更好地進(jìn)行品種保護(hù)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）供試種質(zhì)：試驗(yàn)材料為國家甜菜種質(zhì)資源庫中的627份甜菜多胚種質(zhì)資源，6份甜菜不育系和6份甜菜保持系種質(zhì)資源。（2）引物：引物包括鑒定細(xì)胞質(zhì)育性的TR1引物[15]和鑒定細(xì)胞核育性的T1、T2引物[14]。引物由上海生工生物工程有限公司合成。（3）試驗(yàn)試劑與儀器：異丙醇、液氮、CTAB緩沖液、異戊醇、無水乙醇、2×Rapid Taq Master Mix、熒光核酸染料、瓊脂糖、1×TAE 緩沖液。儀器：震蕩研磨機(jī)、高速離心機(jī)、PCR 儀、凝膠成像儀、紫外分光光度計(jì)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

DNA 提取采用CTAB 法對(duì)甜菜種質(zhì)資源嫩葉進(jìn)行提取[16]，每份種質(zhì)資源隨機(jī)選取5 株進(jìn)行混合取樣。提取完DNA后放于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

對(duì)甜菜細(xì)胞質(zhì)類型和細(xì)胞核Rf1位點(diǎn)基因型鑒定用引物1、引物2及PCR擴(kuò)增體系如表1，PCR擴(kuò)增條件如表2。

表1 甜菜細(xì)胞質(zhì)類型和細(xì)胞核Rf1 位點(diǎn)基因型鑒定的PCR 擴(kuò)增體系Table 1 PCR amplification system for genotype of cytoplasmic type and nucleus Rf1 locus in sugar beet

表2 甜菜細(xì)胞質(zhì)類型和細(xì)胞核Rf1 位點(diǎn)基因型檢驗(yàn)的PCR 擴(kuò)增條件Table 2 PCR amplification conditions for genotype of cytoplasmic type and nucleus Rf1 locus in sugar beet

1.2.3 電泳

PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，吸取5μL 產(chǎn)物點(diǎn)入1%瓊脂糖膠孔中，而后在130 V 電壓下電泳30 min。電泳結(jié)束后利用凝膠成像儀進(jìn)行條帶觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜細(xì)胞質(zhì)類型鑒定

NISHIZAWA 等人[15]在甜菜的線粒體基因組中發(fā)現(xiàn)了4 個(gè)不相關(guān)聯(lián)的串聯(lián)重復(fù)位點(diǎn)TR1、TR2、TR3 和TR4，其中TR1 位點(diǎn)的多態(tài)性最高，串聯(lián)重復(fù)序列的數(shù)量從2～13 個(gè)不等。王有昭[17]用TR1 引物對(duì)甜菜主要品系進(jìn)行擴(kuò)增，而后測序發(fā)現(xiàn)，不育系擴(kuò)增條帶大小在500 bp左右，保持系擴(kuò)增條帶大小在750 bp左右。鑒于此，我們可以通過對(duì)比條帶大小判斷甜菜細(xì)胞質(zhì)類型。

通過對(duì)627 份甜菜多胚種質(zhì)資源進(jìn)行育性組成情況分析，TR1 引物擴(kuò)增出來的條帶類型有500 bp、750/500 bp（既有500 bp 條帶也有750 bp 條帶）、750 bp 和X 型（未知帶型）4 種，即S 型細(xì)胞質(zhì)（不可育細(xì)胞質(zhì)類型）、N/S型細(xì)胞質(zhì)類型（既有可育細(xì)胞質(zhì)類型也有不可育細(xì)胞質(zhì)類型）、N型細(xì)胞質(zhì)（可育細(xì)胞質(zhì)類型）和X型細(xì)胞質(zhì)（未知細(xì)胞質(zhì)類型）。其中N 型有234 份，占37%左右；N/S 型53 份，占8%左右；S 型289 份，占46%左右；X 型51 份，占8%左右，如表3。部分?jǐn)U增結(jié)果如圖1。X 這種帶型在李士龍[18]、王良[19]的試驗(yàn)中均有出現(xiàn)?？梢钥隙ǖ氖沁@種帶型在TR1位點(diǎn)拷貝數(shù)上有別于N 型和S型細(xì)胞質(zhì)。為了進(jìn)一步說明不育系的細(xì)胞質(zhì)類型為S，選取6 株不育系和保持系進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖2。圖2A 中出現(xiàn)的500 bp 左右的條帶即為不育系所擴(kuò)增出來的帶型，圖2B中出現(xiàn)的750 bp左右的條帶即為保持系所擴(kuò)增出來的帶型。

表3 甜菜種質(zhì)資源細(xì)胞質(zhì)類型鑒定Table 3 Identification of cytoplasmic types of sugar beet germplasm resources

圖1 甜菜多胚種質(zhì)資源細(xì)胞質(zhì)類型鑒定Fig.1 Identification of cytoplasmic types of sugar beet polyembryonic germplasm resources

圖2 6份不育系（A）和6份保持系（B）細(xì)胞質(zhì)類型鑒定Fig.2 Identification of cytoplasmic types of six sterile lines(A)and six maintainer lines(B)

2.2 甜菜細(xì)胞核Rf1位點(diǎn)基因型鑒定

利用T1、T2 引物對(duì)DNA 模板進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出來同時(shí)具有1 300 bp 和1 800 bp 以及僅具1 800 bp 兩種帶型，甜菜種質(zhì)資源基因型鑒定結(jié)果如圖3。劉一珺[7]在用T1、T2引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)擴(kuò)增出來3種帶型，而本次試驗(yàn)中沒有單一1 300 bp 這種帶型。試驗(yàn)中，用TR1 引物擴(kuò)增出來的627 份DNA 模板進(jìn)行細(xì)胞核基因型驗(yàn)證，其中同時(shí)具有1 800 bp 和1 300 bp 兩種條帶有78份，僅具1 800 bp條帶有159 份，有390 份沒有擴(kuò)增出條帶。根據(jù)劉一珺[7]對(duì)甜菜用T1、T2 引物擴(kuò)增，得出T1、T2 引物共擴(kuò)增出來1 800 bp、1 300 bp 和1800/1300 bp 三種條帶帶型。本試驗(yàn)有部分種質(zhì)資源盡管用TR1 引物能擴(kuò)增出來N 或者S 型條帶，但T1、T2 引物卻擴(kuò)增不出來相應(yīng)的條帶（表4）。

圖3 甜菜多胚種質(zhì)資源細(xì)胞核Rf1位點(diǎn)基因型鑒定Fig.3 Genotype identification of nucleus Rf1 locus in sugar beet polyembryonic germplasm resources

表4 甜菜種質(zhì)資源育性組成情況統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics of fertility composition of sugarbeet germplasm resources

然后采用6 個(gè)不育系進(jìn)行細(xì)胞核的基因型驗(yàn)證。擴(kuò)增結(jié)果如圖4。結(jié)果均為1 800 bp 條帶。結(jié)合細(xì)胞質(zhì)類型的驗(yàn)證，可以判斷不育株的細(xì)胞質(zhì)基因型為S 型，但細(xì)胞核Rf1位點(diǎn)的基因型還需進(jìn)行酶切驗(yàn)證進(jìn)一步確認(rèn)。

圖4 6份甜菜不育系細(xì)胞核Rf1位點(diǎn)基因型鑒定Fig.4 Genotype identification of nucleus Rf1 locus in six sugar beet sterile lines

3 討論與結(jié)論

利用分子標(biāo)記對(duì)甜菜育性進(jìn)行鑒定具有很大的實(shí)際意義[20]，以往鑒定甜菜不育系和保持系都耗時(shí)較長，而且一旦某個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題就前功盡棄。通過T1、T2引物擴(kuò)增出來的條帶而后進(jìn)行酶切驗(yàn)證可以判斷細(xì)胞核Rf1位點(diǎn)基因型，若細(xì)胞質(zhì)類型為N或者S 型就可以判定其為保持系或者不育系。有部分種質(zhì)資源用T1、T2 引物沒有擴(kuò)增出來結(jié)果，推測其產(chǎn)生的原因?yàn)椋?1)模板發(fā)生降解，導(dǎo)致引物所擴(kuò)增位點(diǎn)不存在；(2)T1、T2引物的擴(kuò)增位點(diǎn)突變，導(dǎo)致引物無法與相應(yīng)區(qū)域結(jié)合。在細(xì)胞質(zhì)育性鑒定時(shí)出現(xiàn)了N/S型細(xì)胞質(zhì)帶型，這是由于采樣時(shí)混樣造成的。因此，若是想進(jìn)一步了解甜菜種質(zhì)資源整體育性情況，采取抽樣調(diào)查，單株鑒定是一個(gè)更為可行的方式。

1945 年，歐文提出X和Z基因座的互補(bǔ)作用控制甜菜的雄性不育或可育[21]，后來他又指出這種遺傳模型并不能解釋他所做的所有雜交結(jié)果。1950年，歐文又提出X 基因座上的育性恢復(fù)基因X（即Rf1基因）對(duì)于甜菜的育性恢復(fù)起到至關(guān)重要的作用，而Z基因座對(duì)甜菜育性恢復(fù)的影響較小[22]，因此鑒定Rf1基因型對(duì)于甜菜的育性鑒定至關(guān)重要。MORITANI 等人[23]在研究中建立了兩個(gè)分子標(biāo)記，這兩個(gè)分子標(biāo)記可以在甜菜群體中對(duì)保持系基因型進(jìn)行簡單而快速的分析，盡管最終確認(rèn)仍需進(jìn)行試驗(yàn)雜交，但這兩種DNA 標(biāo)記的預(yù)選擇可以減少保持系選擇的規(guī)模。因?yàn)榭梢栽诿缙诰瓦M(jìn)行篩選，所以使用這種新的標(biāo)記系統(tǒng)將大大減少這一作物品種育種計(jì)劃所需的勞動(dòng)力，但該分子標(biāo)記方法的一個(gè)局限性是標(biāo)記系統(tǒng)不能完全準(zhǔn)確有效地識(shí)別每一個(gè)保持系。目前，甜菜細(xì)胞質(zhì)育性基因型已經(jīng)可以用分子標(biāo)記很好地區(qū)分出來[15]，細(xì)胞核的Rf1位點(diǎn)基因型通過分子標(biāo)記也能很輕易區(qū)分出來[14,24-25]。在對(duì)細(xì)胞核基因型進(jìn)行鑒定時(shí)，劉一珺[7]利用TAGUCHI等人[14]所述的引物對(duì)甜菜基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生了3種帶型，而其中的1 800 bp大小的帶型經(jīng)過酶切后的4/4模式帶型和保持系帶型吻合，而另外兩種帶型卻不確定具體的基因型，因此，這兩種帶型是否也對(duì)應(yīng)相應(yīng)的甜菜細(xì)胞核基因型需要結(jié)合分子標(biāo)記和田間試驗(yàn)進(jìn)一步探究。未來，利用分子標(biāo)記準(zhǔn)確地確定每一株甜菜的育性情況對(duì)于以后的甜菜育種工作具有重要意義。

在用TR1 引物對(duì)甜菜DNA 模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，出現(xiàn)嚴(yán)重的彌散現(xiàn)象。起初進(jìn)行退火溫度的調(diào)整，但去除效果不明顯。后把循環(huán)數(shù)調(diào)整為25，彌散現(xiàn)象才基本消除，但仍然有個(gè)別彌散現(xiàn)象，疑似人為加樣時(shí)導(dǎo)致DNA 模板未能加入。另外，在擴(kuò)增結(jié)果中出現(xiàn)了N/S型（即有750 bp 的條帶，也有500 bp的條帶）的現(xiàn)象，這是由于混合取樣造成的，這種N/S雙帶型表明樣品中既有可育細(xì)胞質(zhì)類型也有不育細(xì)胞質(zhì)類型。

試驗(yàn)通過對(duì)國家甜菜種質(zhì)資源庫中的部分甜菜種質(zhì)資源進(jìn)行育性鑒定表明，627 份種質(zhì)資源中不育型細(xì)胞質(zhì)類型占46%左右，可育型細(xì)胞質(zhì)類型占37%左右。對(duì)于T1、T2 引物擴(kuò)增條帶為1800/1300 bp 的種質(zhì)資源是否是1800/1300 bp型或者1 800 bp 和1 300 bp型的混合仍未可知。但從總體來看，國家甜菜種質(zhì)資源庫中的資源育性程度較復(fù)雜，在后續(xù)育種中需要對(duì)其進(jìn)行單株篩選。