韓玉瑩，林港華，代容春，楊賜珠，薛婷，陳由強，何文錦

（1.福建師范大學生命科學學院，福州 350117；2.福建師范大學南方海洋研究院，福州 350117）

0 引言

海洋微藻已被作為各類生物反應器廣泛研究，用于合成高價值的天然活性化合物，包括天然色素、天然多不飽和脂肪酸和活性蛋白質等[1-3]。湖泊紅球藻（Haematococcus lacustris,H.lacustris）是綠藻門紅球藻屬的淡水單細胞微藻，生活史可分為營養(yǎng)生長期、包囊期、成熟期和萌發(fā)期。光照40μmol/(m2·s)、pH=8.8、生長溫度(20±1)℃是湖泊紅球藻最佳生長條件[4]；它還是一種光敏性微藻，在強光照射及其他脅迫條件下易積累蝦青素，提高自身抗逆能力，并可作為天然蝦青素的來源，具有很好的發(fā)展前景。

蝦青素是廣泛存在于自然界中的類胡蘿卜素含氧衍生物，分子式C40H52O4，分子結構中含有共軛雙鍵及不飽和酮基、羥基，因此極易與自由基反應進而清除自由基，具有很強的抗氧化性。除此之外，天然蝦青素還具有抗炎、抗癌和抗增殖作用，可提高常規(guī)化療藥物在皮下腫瘤細胞中的效率。蝦青素純品為暗紅棕色粉末，易溶于二氯甲烷、丙酮等多種有機溶劑[5-7]。當今市場中蝦青素主要來源于天然產物的提取和人工化學合成兩種途徑，其中化學合成為主要生產方式，但化學合成的蝦青素在抗氧化活性與穩(wěn)定性較差且生物安全性低[8]。所以人工合成的蝦青素尚未被批準作為食品添加劑直接用于人類使用[9]。綠藻門的湖泊紅球藻被認為是自然界中生產天然蝦青素最好的生物之一，其蝦青素含量高，且以左旋結構為主，可很好地發(fā)揮其生物功效[10]。海洋微藻合成的天然蝦青素安全性高，應用范圍廣，需求量大，可被用于化妝品、保健品等領域。

BG11培養(yǎng)基是一種應用比較廣泛的淡水藻培養(yǎng)基，通常用來培養(yǎng)淡水藍藻、綠藻和原生動物，適用范圍廣泛。通常情況下，培養(yǎng)基未添加碳源，可根據(jù)不同海藻的習性特點，添加適合的碳源以促進其生長。

甘蔗糖蜜是制糖工業(yè)將壓榨出的甘蔗汁液，經加熱、中和、沉淀、過濾、濃縮、結晶等制糖工序后剩下的黑褐色濃稠液體，是制糖業(yè)的副產品之一。甘蔗糖蜜組分多樣，營養(yǎng)豐富，含有大量的發(fā)酵糖（蔗糖），還含有豐富的生物素、有機酸及各種礦質元素，可制作飼料添加劑、充當發(fā)酵輔料，也可作為微生物培養(yǎng)基的復合碳源等[11-15]。利用糖蜜進行微藻的培養(yǎng)，相較于葡萄糖等來說，可以大幅度降低成本；同時廢物利用，不但綠色環(huán)保，更具有良好的生態(tài)環(huán)境效益[16-18]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

湖泊紅球藻藻種H5 購于武漢水生所，經純化鑒定，保種于本實驗室。糖蜜購自廣西柳州市金黔灣糖蜜有限公司。高效液相色譜儀HPLC 2695，Sun Fire C18250×4.6/5μm（18600 2560）色譜柱以及配套保護柱，購自美國Waters公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 糖蜜預處理

糖蜜為深褐色粘稠半流動液體，需要對糖蜜進行預處理，預處理方法參照陳建楠甘蔗糖蜜預處理方法[19]。預處理后糖蜜溶液為淺褐色液體，對吸光值測定有影響，測定前將其稀釋至10-4接近無色。通過紫外分光光度計測定470 nm波長時的吸光值，依據(jù)標準曲線，計算出糖蜜溶液的總糖含量。

1.2.2 苯酚硫酸定糖法測定糖蜜總糖含量

采用苯酚-硫酸法制備葡萄糖溶液標準曲線，設置20、40、60、80、100μg/mL 五個濃度梯度，通過紫外分光光度計，分別檢測每個濃度的3組樣品，在波長為470 nm時的吸光值，得到線性方程：

1.2.3 藻種培養(yǎng)

第一階段：正常光照下湖泊紅球藻的生長擴繁培養(yǎng)階段。對照組為BG11 培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天搖瓶2 次。培養(yǎng)條件：光照強度40μmol/(m2·s)，溫度（20±1）℃，光照周期12 h∶12 h，每組6個重復。試驗組為在BG11培養(yǎng)基中分別添加總糖含量為0.5、1、1.5 g/L 的糖蜜（TM）或葡萄糖（G）進行培養(yǎng)，每天搖瓶2 次。培養(yǎng)條件同對照組一致。每組6 個重復。第二階段：高光條件湖泊紅球藻積累蝦青素培養(yǎng)階段。當湖泊紅球藻進入快速生長時期，將對照組與試驗組的每一濃度3 個重復，轉移至高光下，培養(yǎng)條件：光照強度150μmol/(m2·s)，溫度（20±1）℃，光照周期12 h∶12 h，每天搖瓶2次。

1.2.4 湖泊紅球藻細胞密度與干重測定

利用血球計數(shù)板計算湖泊紅球藻細胞密度。先稱量10 mL 離心管的管重，在超凈臺中準確吸取10 mL均勻的湖泊紅球藻培養(yǎng)液至稱量好管重的離心管中，4 ℃、8 000 r/min，離心10 min，用蒸餾水洗滌2 次，離心后棄上清，先置于-80 ℃12 h，再冷凍干燥48 h，稱量此時離心管重量，得出湖泊紅球藻干重。

1.2.5 蝦青素的提取與檢測

利用HPLC對1、2、5、10、20 μg/mL五個濃度梯度的蝦青素標準品溶液進行檢測，得到線性方程：

湖泊紅球藻蝦青素的提取方法參考國標GB/T 31520-2015[20]。檢測蝦青素的高效液相色譜條件參數(shù)為：檢測器PDA；流動相甲醇∶去離子水＝95∶5（V∶V），超聲波脫氣；流速1 mL/min;檢測波長474 nm；進樣量20 μL；柱溫25 ℃。

目前,我國老年腦梗塞患者比較普遍,其作為腦血管病癥中常見一種,導致其發(fā)病因素為腦組織缺血缺氧、腦部血流供應障礙而引發(fā)的有關腦部供血區(qū)域出現(xiàn)壞死、軟化,進而致使神經功能損傷,該疾病的發(fā)病率和死亡率較高,一旦未及時進行治療,則會導致患者留下后遺癥,影響其身體健康和生活質量[1]。本文研究選取本社區(qū)的60例老年腦梗塞患者,對其分別采取單一舒血寧和依達拉奉并用方式,探究其治療成效?，F(xiàn)將詳細探究內容進行如下報告。

2 結果與分析

2.1 外源添加糖蜜或葡萄糖的培養(yǎng)基對湖泊紅球藻細胞生長的影響

在正常光照強度40μmol/(m2·s)，培養(yǎng)至45 d時，對照組藻細胞生長量達到最大，為8.44×106個/mL，而添加0.5 g/L糖蜜或葡萄糖試驗組的藻細胞在培養(yǎng)至45 d時，藻細胞生長量達到最大，分別為8.90×106個/mL和9.44×106個/mL。從圖1A 可見，與對照組相比，糖蜜或葡萄糖試驗組都對湖泊紅球藻的生長有顯著的促進作用，不但可獲得更高的藻細胞生長量，也有更長的藻細胞增殖期。不同總糖濃度的糖蜜或葡萄糖試驗組中，低糖濃度培養(yǎng)基也都比高糖濃度培養(yǎng)基更有利于湖泊紅球藻的生長，能獲得更高的藻細胞密度。相同總糖濃度的葡萄糖培養(yǎng)基比糖蜜培養(yǎng)基更有利于促進藻細胞的增殖。

圖1 正常光照強度（A）和高光照強度（B）下不同濃度糖蜜或葡萄糖對湖泊紅球藻細胞密度的影響Fig.1 Effects of different concentrations of molasses or glucose on the cell density of H.lacustris under normal light intensity(A)and high light stress(B)

2.2 高光脅迫下不同濃度糖蜜或葡萄糖的培養(yǎng)基對湖泊紅球藻細胞密度的影響

在150μmol/(m2·s)高光照強度培養(yǎng)下，對照組和試驗組的藻細胞密度呈現(xiàn)基本穩(wěn)定不再快速增長狀態(tài)，并逐漸衰亡。圖1B 顯示高光培養(yǎng)條件不適合湖泊紅球藻生物量的增長，而且會抑制藻細胞的生長。從圖1B可見，與對照組相比，添加糖蜜或葡萄糖培養(yǎng)基，都比對照組更有利于維持藻細胞的活性。不同總糖濃度的糖蜜或葡萄糖培養(yǎng)基，低糖濃度培養(yǎng)基也都比同組的高糖濃度培養(yǎng)基更有利于維持藻細胞活性。由此可知，高光培養(yǎng)條件不利于藻細胞增殖生長，藻細胞比正常培養(yǎng)條件更早進入衰亡期。

2.3 不同濃度糖蜜或葡萄糖的培養(yǎng)基對湖泊紅球藻合成蝦青素的影響

在高光照150μmol/(m2·s)培養(yǎng)的第20 d、25 d 和30 d，總糖0.5 g/L 的糖蜜培養(yǎng)基培養(yǎng)下湖泊紅球藻細胞的蝦青素含量分別為10.04 mg/L、12.62 mg/L 和11.88 mg/L，顯著高于對照組和相同總糖濃度的葡萄糖試驗組（如圖2A），分別是對照組的1.38 倍、1.82 倍和1.86 倍，分別是相同濃度葡萄糖培養(yǎng)基的1.66 倍、2.06 倍和1.33 倍。由此可見，添加低濃度糖蜜作為碳源有利于湖泊紅球藻蝦青素的積累，結合藻細胞生長情況分析，低濃度糖蜜培養(yǎng)基既有利于維持藻細胞活性，又有利于藻細胞中蝦青素的積累。為獲得較高含量的蝦青素，可在糖蜜濃度0.5 g/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)第25 d進行提取。

2.4 添加不同濃度糖蜜或葡萄糖的培養(yǎng)基對湖泊紅球藻干重的影響

在光照150μmol/(m2·s)培養(yǎng)的第20 d、25 d 和30 d，總糖0.5 g/L的糖蜜培養(yǎng)基培養(yǎng)下的湖泊紅球藻細胞干重為16.8 mg/L、28.3 mg/L和30.8 mg/L（如圖2B），分別是對照組的1.14 倍、1.31 倍和1.81倍。就總體趨勢而言，總糖0.5 g/L 的糖蜜培養(yǎng)基培養(yǎng)下的細胞干重顯著高于對照組和相同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基，分別是相同濃度葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)下藻細胞干重的0.99 倍、1.39 倍和1.80 倍?？梢娞砑拥蜐舛忍敲蹫樘荚从欣谠黾雍醇t球藻的細胞干重。

圖2 不同濃度糖蜜或葡萄糖對湖泊紅球藻蝦青素含量（A）及湖泊紅球藻干重（B）的影響Fig.2 Effects of different concentrations of molasses or glucose on astaxanthin content(A)and dry eight(B)of H.lacustris

3 討論與結論

湖泊紅球藻是一種光合自養(yǎng)，能合成天然強抗氧化活性物質——蝦青素的淡水單細胞綠藻。本試驗以BG11 培養(yǎng)基為對照組，以在BG11 培養(yǎng)基中添加糖蜜或葡萄糖為試驗組培養(yǎng)湖泊紅球藻，研究不同培養(yǎng)條件對湖泊紅球藻細胞生長及代謝活性物質——蝦青素積累的影響。經試驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基添加糖蜜或葡萄糖低濃度碳源，有利于促進湖泊紅球藻細胞的增殖，生長速率加快，生物量得到顯著提高。該結果與前人試驗所得結論相似[21]，同樣具有參考價值。我們還發(fā)現(xiàn)，添加低濃度糖蜜或葡萄糖碳源更有利于保持藻細胞活力，而且低濃度的糖蜜有顯著促進藻細胞積累蝦青素的作用。

本實驗室也通過在f/2培養(yǎng)基中添加糖蜜或葡萄糖來培養(yǎng)三角褐指藻，結果顯示添加糖蜜的培養(yǎng)基培養(yǎng)三角褐指藻，其生長量、巖藻黃素含量、總脂肪酸含量、EPA 含量均有所提高，并且同樣是低濃度的糖蜜具有促進作用（待發(fā)表）。王紹杰等人在分批發(fā)酵試驗基礎上，進行了底物糖蜜流加補料發(fā)酵試驗，結果顯示，酵母菌的代謝產物麥角甾醇產量與生產效率均有顯著提高[22-25]。

通過試驗發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.5 g/L的糖蜜或葡萄糖時，湖泊紅球藻的生長量、合成蝦青素含量都比BG11 培養(yǎng)基培養(yǎng)的湖泊紅球藻的含量有顯著提高。葡萄糖和糖蜜作為碳源相比，低濃度葡萄糖培養(yǎng)基對促進藻細胞生長的作用略優(yōu)于糖蜜培養(yǎng)基，而低濃度糖蜜培養(yǎng)基比葡萄糖培養(yǎng)基能更顯著地促進藻細胞在高光脅迫下合成蝦青素。為使湖泊紅球藻細胞密度達到最大，可在培養(yǎng)基中分別添加0.5 g/L的糖蜜和葡萄糖，同時在培養(yǎng)的第45 d 進行收獲。為獲得較高含量的蝦青素，可在糖蜜濃度0.5 g/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)第25 d進行提取。

通過前人的研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素的合成受蝦青素合成酶系基因psy和crtZ的調控，在施加醋酸鈉、硫酸亞鐵和強光照射等有效的蝦青素誘導條件下，表達水平上升[26-29]。在GRUNEWALD 等[30]的試驗中也觀察到，蝦青素合成酶基因pds和crtO的基因轉錄水平在脅迫誘導下均上調。本試驗在高光照培養(yǎng)下，有可能誘導藻細胞蝦青素合成酶系基因的表達水平，試驗結果顯示，同時添加低濃度糖蜜后，能顯著促進湖泊紅球藻細胞活性和藻細胞蝦青素積累量。由此我們猜測，糖蜜中含有多種生物活性因子，與高光培養(yǎng)條件共同作用，有可能調控藻細胞蝦青素合成酶系基因的活性，最終達到蝦青素的大量積累。

雖然甘蔗糖蜜是蔗糖工業(yè)的廢棄物，但它是海藻養(yǎng)殖的優(yōu)質碳源。而且價格遠低于葡萄糖。所以將生產廢棄物糖蜜作為海藻培養(yǎng)基碳源添加物，既可降低生產成本，又可獲得高附加值的天然生物活性物質，變廢為寶，環(huán)保節(jié)能，是實現(xiàn)經濟效益和社會效益兼顧雙贏的利用方法。