姚周麟 吳韶輝 林 媚平新亮

（浙江省柑橘研究所 臺州 318026）

柚皮素（Naringenin，NAR）是一種天然的類黃酮物質(zhì)，屬于二氫黃酮類，是柚皮苷（Naringin）的苷元，主要存在于蕓香科植物如葡萄柚、橙、佛手柑等柑橘類水果中。柚皮素在常溫下為白色針狀結(jié)晶，溶于乙醇、乙醚和苯等有機(jī)溶劑，幾乎不溶于水。柑橘中的柚皮素主要存在果皮中，如溫州蜜柑和紅美人的果皮中的柚皮素含量達(dá) 4.82、11.36 mg/kg[1]，果肉僅分別為0.09、0.20 mg/kg；李勛蘭等[2]研究了11種柑橘果肉的柚皮素含量也發(fā)現(xiàn)僅有 0.01～0.28 mg/kg。

柚皮素具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗腫瘤、解痙和利膽、預(yù)防和治療肝病、抑制血小板凝結(jié)、抗粥樣動脈硬化等多種藥理活性（圖1）。如柚皮素能減輕抗結(jié)核藥引起的大鼠肝腎損傷[3]；促進(jìn)糖尿病大鼠中二甲雙胍的清除[4]；可作為 T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性炎癥疾病的預(yù)防/治療劑[5]和免疫相關(guān)疾病治療劑中潛在的免疫調(diào)節(jié)劑[6]；可減少I型糖尿病大鼠晶狀體的氧化應(yīng)激標(biāo)志物[7]，用于多種氧化應(yīng)激疾病[8]；能有效抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移[9]；柚皮素納米制劑在預(yù)防和治療癌癥中有潛力[10]，和橙皮素聯(lián)合治療一種胰腺癌而不會引起對正常細(xì)胞的毒性[11]等，可被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。本文綜述了柑橘柚皮素的提取與手性對映體拆分方法等方面的研究，并對手性柚皮素的研究方向進(jìn)行了展望，為柑橘中手性類黃酮物質(zhì)的開發(fā)利用提供理論參考。

圖1 柚皮素抗氧化作用原理

1 柚皮素的提取方法

柚皮素的提取對分析結(jié)果至關(guān)重要，某種程度上來說，前處理決定了分析測試的結(jié)果，直接影響分析數(shù)據(jù)的精確性。柑橘中柚皮素等類黃酮成分檢測的前處理提取方法常用的為溶劑萃取法[12]，利用該組分在兩種互不相溶的試劑中分配系數(shù)的不同，使其從一種溶液轉(zhuǎn)移至另一種溶劑，從而達(dá)到分離和富集的目的，但萃取溶劑通常易揮發(fā)、易燃、用量大，且有毒性；其他方法還有酶解法、超聲波提取法等。

1.1 單一提取法

國內(nèi)外研究人員對植物中類黃酮等有效成分的提取方法做了較多的研究。Wu[13]等用深共熔溶劑（Deep-eutectic Solvent，DES）輔助超聲萃?。║ltrasound-assisted extraction，UAE）辣木的總酚和類黃酮含量，提供了一種綠色高效的方法；Molina[14]等用沖擊波輔助提取太子參藥材中酚酸和類黃酮，與常規(guī)溶劑法比，提取效率明顯更高；Mai[15]等通過超聲輔助萃取和溫度誘導(dǎo)濁點提取（Temperatureinduced cloud point extraction，TICPE），開發(fā)了一種從大葉黃楊中同時提取和富集類黃酮化合物的綠色方法，具有更高的萃取效率和更好的萃取選擇性；Yu[16]等用超聲波輔助提取積雪草中類黃酮，顯著提高了提取率；Song[17]等用超臨界二氧化碳流體萃取新疆棗葉中黃酮類化合物，可得到更高的總類黃酮含量及更強(qiáng)的抗氧化和抗增殖活性。

1.2 酶解提取法

更完全地提取有效成分，必須去掉由果膠質(zhì)、纖維素和半纖維素及木質(zhì)素等構(gòu)成的細(xì)胞壁，而采用生物酶解法是專一高效的催化方法。酶不僅用于細(xì)胞壁降解，還有利于增加目標(biāo)化合物的溶解度，增加提取效率。常用的酶如果膠酶（Polygalacturonase）是一組復(fù)雜的酶，可降解植物組織中存在的各種果膠類物質(zhì)[18]，在水果、造紙和紡織工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用。Chen等用酶解輔助提取銀杏葉中黃酮類化合物，改善了提取效果，提高了提取率[19]；細(xì)胞壁降解酶能改善從小球藻中提取脂質(zhì)的能力[20]；堿預(yù)處理再輔助酶處理，能破壞細(xì)胞壁并從擬微球藻中提取脂質(zhì)[21]；纖維素酶增加了稻草糖化過程中酚酸的釋放[22]；Wilkins等用纖維素酶和果膠酶水解葡萄柚果皮廢料，產(chǎn)生糖，將其用于生產(chǎn)乙醇[23]；Wei等用雙酶輔助鹽漬法提取草種子中的黃酮，可用于大量生產(chǎn)類黃酮[24]。

1.3 超聲波提取法

超聲波獨(dú)具的物理特性能促使植物細(xì)胞組織破壁或變形，使有效成分提取更充分，可直接用于提取目標(biāo)化合物，是一種比較常見的類黃酮提取方法。Qiao等利用超聲波聲化學(xué)作用處理了柑橘中14種類黃酮[25]；Yang[26]等使用結(jié)合熱回流萃?。℉eat Reflux Extraction，HRE）和超聲輔助的聯(lián)用方法（Heat and Ultrasonics-assisted Extraction，HUAE）從半枝蓮中提取類黃酮，明確了該方法的優(yōu)越性。Meng[27]等用超聲輔助深共熔溶劑提取黃酮，除了減少了對環(huán)境的影響，更提高了提取效率；Belwal[28]等用超聲波輔助大規(guī)模提取梨果皮中花色苷，用于大批量提取和工業(yè)應(yīng)用。

1.4 超聲波輔助酶解提取法

超聲波也是酶催化反應(yīng)的強(qiáng)大工具，可以影響酶和底物的結(jié)合，進(jìn)而改善果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶活性[29]。超聲通過瞬時空化在介質(zhì)中產(chǎn)生的強(qiáng)對流而增加了酶促過程中的碰撞次數(shù)，并通過增加酶與有機(jī)分子之間的相互作用來提高降解效率[30]，因此采用超聲波輔助酶解可以有效提高反應(yīng)效率。低頻超聲的振幅，反射器的存在，與角的距離和基板的形狀均可影響纖維素酶水解的效率[31]。通過超聲可增強(qiáng)甘蔗渣的酶解作用，還原糖釋放的增加[32]；Subhedar[33]等利用超聲波輻照輔助酶促水解生產(chǎn)可發(fā)酵糖，進(jìn)一步生產(chǎn)生物乙醇；Lei[34]等酶解-超聲輔助（EUAE）提取甜茶樹中的黃酮類化合物；張[35]等采用超聲波輔助酶法提取桑葚酒殘留物中花色苷，提高了生產(chǎn)效率；Subhedar[36]等利用超聲波強(qiáng)化廢報紙的酶促水解以生產(chǎn)可發(fā)酵的糖，將木質(zhì)纖維素有效轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖進(jìn)而生產(chǎn)生物乙醇，超聲和酶的組合具有協(xié)同作用，可降低對酶和底物結(jié)合的擴(kuò)散限制，并提高反應(yīng)速率。

2 手性柚皮素的拆分方法

2.1 外消旋柚皮素的分析方法

關(guān)于類黃酮功能性成分的外消旋檢測前人已經(jīng)做了較多的研究，較新的檢測方法包括：HPLC-DAD[37]、UHPLC-QqQ-MS/MS[38]、UPLC-QTOF-MS[39]等。外消旋柚皮素的檢測方法也有一些研究：UHPLC-QqQ-MS/MS[12]、傅里葉變換紅外光譜和高效液相色譜-紫外檢測-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜[25]、LC-MS/MS[40]、SM-USA-MSPD-高效液相色譜法聯(lián)用[41]，均能滿足實驗需要。

2.2 手性旋柚皮素的拆分方法

目前，對于柚皮素功能方面的研究，均以外消旋體進(jìn)行。事實上，柚皮素為手性化合物，有兩個對映異構(gòu)體（圖2），手性對映體有相同的分子量、熔點、溶解度等，但也存在一些理化性質(zhì)的差異。手性柚皮素與手性物質(zhì)相互作用極有可能產(chǎn)生不同的產(chǎn)物，特別是許多與生物體密切相關(guān)的生化反應(yīng)均和物質(zhì)的手性相關(guān)聯(lián)。而目前尚未有手性柚皮素單體絕對構(gòu)型的確認(rèn)及手性單體的功能性研究。這是值得期待的研究領(lǐng)域，特別當(dāng)一種對映體具有有益的生理活性，而另一種對映體對人體有害時，手性成分研究顯得尤為重要。1960年代的“反應(yīng)?！敝禄录?，就是手性化合物其中一個構(gòu)型引起的慘劇。

圖2 手性柚皮素的兩個對映異構(gòu)體

手性柚皮素的儀器拆分方法主要為液相色譜（High performance liquid chromato-graph，HPLC）和液相色譜質(zhì)譜（High performance liquid chromatography-Mass，HPLC-MS）聯(lián)用，目前研究進(jìn)展僅處于對映體的拆分，尚未確定柚皮素R-和S-的絕對構(gòu)型，作為一個完整的檢測方法，均還有待完善。Gaggeri[42]等采用高效液相色譜分離了幾種果汁柚皮素，最終確認(rèn)在手性柱Chiralpak AD-H用純甲醇（不含酸性或堿性添加劑）洗脫，分離度高，但該方法分離時間長，未做絕對構(gòu)型和方法學(xué)確認(rèn)。Si-Ahmed[43]等使用苯基氨基甲酸酯-丙基-β-環(huán)糊精手性固定相的納米液相色譜分離了柚皮素，該方法只保證了兩個單體的分離，同樣未做絕對構(gòu)型和方法學(xué)確認(rèn)；Wang[44]等開發(fā)的高速逆流色譜（Highspeed Countercurrent Chromatography，HSCCC）結(jié)合銅(II)-手性離子液體配合物和羥丙基-環(huán)糊精，重點做了兩個單體的分離，絕對構(gòu)型和方法學(xué)均未做確認(rèn)，且分離時間長，流動相復(fù)雜；Baranowska[45,46]等同時發(fā)表了兩篇關(guān)于柚皮素手性分離的研究，內(nèi)容比較相似，采用RP-UHPLC-DAD的方法，拆分了對映體單體。

質(zhì)譜是一種測量離子質(zhì)荷比（質(zhì)量-電荷比）的分析方法，其基本原理是使試樣中各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質(zhì)比的帶電荷的離子，經(jīng)加速電場的作用，形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中，再利用電場和磁場使發(fā)生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量。也就是說，質(zhì)譜是沒辦法確認(rèn)立體結(jié)構(gòu)，只能確定質(zhì)量，因此，建立完善的手性柚皮素拆分方法具有非常大的必要性和緊迫性。

3 小結(jié)

目前，對柑橘類黃酮物質(zhì)的研究還集中在外消旋混合物的分析和功能驗證，對手性類黃酮對映體的單獨(dú)或差異性研究仍鮮有報道。因此，建議在今后開展以下幾個方面的研究：一是在以柑橘類果皮、果肉和全果等為材料的手性柚皮素研究過程中，應(yīng)采用綠色、高效的復(fù)合酶和超聲波協(xié)同技術(shù)，綜合考慮溫度、pH等對柚皮素溶解度和穩(wěn)定性的影響[47]，優(yōu)化最佳的前處理條件，降低目標(biāo)功能性成分的損失，為精準(zhǔn)鑒定評價手性柚皮素。二是開展手性柚皮素單體的功能性驗證。通過對柑橘柚皮素進(jìn)行手性單體制備，開展抗氧化能力差異性評價。三是通過分子生物學(xué)技術(shù)，開展柑橘類手性柚皮素的基因調(diào)控、代謝組學(xué)等機(jī)理研究，為提高柑橘優(yōu)質(zhì)資源開發(fā)利用提供理論參考。