王 敬，張海超，陳敏娜，艾連峰，張亦琴

（石家莊海關(guān)技術(shù)中心，河北 石家莊 050051）

乳制品是高營養(yǎng)食品，不僅含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物，還含有人體必需的維生素和微量元素，已成為人們?nèi)粘ＯM(fèi)最多的食品之一。而乳制品中農(nóng)藥殘留是影響乳品安全的因素之一，尤其乳制品產(chǎn)業(yè)鏈長，農(nóng)藥殘留可通過食物鏈蓄積，進(jìn)而對(duì)人體造成長期、微劑量及慢性細(xì)微毒性效應(yīng)。這種毒性效應(yīng)起病緩慢、持續(xù)期長、涉及面廣、影響人數(shù)多，可在人體生理、自身免疫功能、致癌、致畸及致突變等方面反映出來［1－4］。乳品中農(nóng)藥殘留主要是因?yàn)槟膛＿M(jìn)食了被農(nóng)藥污染的飼料，或在使用殺蟲劑控制奶牛身上的真菌、細(xì)菌、線蟲等及周圍的蒼蠅、蚊蟲時(shí)混入奶中，擠奶設(shè)備、用具及其它牛奶接觸到的物品也均可能產(chǎn)生殘留。我國以及歐盟、日本、美國和中國香港等國家和地區(qū)不斷修訂乳及乳制品中殺蟲劑、除草劑和殺菌劑等農(nóng)藥的最高殘留限量（MRLs）。其中，中國香港《食物內(nèi)除害劑殘余規(guī)例》制定了牛奶中142種農(nóng)藥殘留限量；歐盟制定了乳品中460多種農(nóng)藥殘留限量；美國制定了牛奶中190余種農(nóng)藥殘留限量；澳大利亞制定了牛奶中227種農(nóng)藥殘留限量；日本制定了牛奶中373種農(nóng)藥殘留限量［4］。2020年2月15日實(shí)施的GB2763－2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》［5］規(guī)定了109種農(nóng)藥在肉、蛋、奶等動(dòng)物源性農(nóng)產(chǎn)品中的703項(xiàng)農(nóng)藥最大殘留限量，其中殺撲磷低至0.001 mg/kg，七氯和艾氏劑均為0.006 mg/kg，嘧菌環(huán)胺更是低至0.0004 mg/kg。

近年來，我國有關(guān)機(jī)構(gòu)對(duì)于乳制品中農(nóng)藥殘留的監(jiān)管力度不斷加大。已頒布的GB23200.86－2016、GB23200.90－2016和GB23200.85－2016［6－8］等國家標(biāo)準(zhǔn)大多只檢測一種或一類農(nóng)藥殘留，覆蓋范圍窄；GB/T23210－2008［9］雖然涉及農(nóng)藥面廣，但前處理方法較為繁瑣，基質(zhì)單一，且由于采用GC－MS測定，許多農(nóng)藥的檢出限無法滿足GB2763－2019的限量要求。為了更好地滿足市場需求，乳制品中農(nóng)藥多殘留快速檢測的方法研究已逐漸成為熱點(diǎn)。乳制品組成成分較多，主要的基質(zhì)干擾成分有脂肪、磷脂、蛋白質(zhì)、糖類等，常用液液萃取法、凝膠滲透法、固相萃取法、低溫冷凍除脂法和QuEChERS法等前處理方法［4，10－15］。其中，QuEChERS法具有操作簡單、快速、實(shí)用、高效等優(yōu)點(diǎn)，可滿足快速處理大批量農(nóng)藥殘留樣品的需求。

GB2763－2019國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)自發(fā)布以來，對(duì)食品行業(yè)從種植（養(yǎng)殖）、加工直至餐桌消費(fèi)整個(gè)閉環(huán)產(chǎn)生了巨大影響。已有文獻(xiàn)研究了牛奶中農(nóng)藥殘留，但對(duì)GB2763－2019規(guī)定的乳制品中農(nóng)藥殘留分析研究尚未見報(bào)道。本文在前期研究基礎(chǔ)上［4］，對(duì)GB2763－2019中涉及的多數(shù)農(nóng)藥進(jìn)行了分析研究，涉及農(nóng)藥種類占全部總限量數(shù)的54%。采用具有較好選擇性和靈敏度的氣相色譜－質(zhì)譜/質(zhì)譜儀結(jié)合QuEChERS凈化技術(shù)，并優(yōu)化前處理方法和儀器上機(jī)條件，建立了氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測乳制品中232種農(nóng)藥多殘留的分析方法，為推進(jìn)乳品中農(nóng)藥殘留相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TRACE1310－TSQ8000Evo氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、TG－5SilMS氣相色譜柱（30mm×0.25 mm×0.25 μm）（美國Thermo Fisher Scientific公司）；電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Turbo Vap LV型氮吹濃縮儀（Zymark公司）；ALLEGRA X－15R型離心機(jī)（美國Beckman公司）；Milli-Q純化系統(tǒng)（Millipore公司）。

232種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)（Dr.Ehrenstorfer和Sigma公司）；乙腈、乙酸、丙酮、正己烷均為色譜純（美國Dikma公司）；無水硫酸鎂（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷（C18）、石墨化炭黑（GCB）購自美國Dikma公司。

供試樣品：牛奶、羊奶、奶粉、酸奶、原料奶和奶酪采購于本地市場。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：稱取約5～10mg（精確至0.1 mg）各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品分別置于10mL容量瓶中，根據(jù)各物質(zhì)的溶解性選用甲苯或丙酮溶解并定容至刻度，于－20℃冰箱中保存?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的配制：移取一定量各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100mL容量瓶中，用丙酮－正己烷（體積比1∶1，下同）定容并配成100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于－20℃冰箱中保存。內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取環(huán)氧七氯（內(nèi)標(biāo)），用丙酮－正己烷（1∶1）逐級(jí)稀釋成20μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，于－20℃冰箱中保存。基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用樣品空白提取液配成系列基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理 液體乳制品：稱取試樣約10g（精確至0.01 g）于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入15mL1%乙酸乙腈、6g無水硫酸鎂、1.5 g無水醋酸鈉及1顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈振蕩1min后以5000r/min離心5min，吸取5mL上清液加入內(nèi)含900mg無水MgSO4、50mg C18和50mg PSA的離心管中，渦旋混勻1min，以5000r/min離心5min。準(zhǔn)確吸取3mL上述離心后的上清液于10mL試管中，于40℃氮?dú)獯抵两桑帽和椋?∶1）定容至1mL，加入10μL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲溶解30s，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，待測定。

固體乳制品：稱取試樣5g（精確至0.01 g）于50mL離心管中，加入10mL40～45℃水重復(fù)溶解并浸泡30min，再加入15mL1%乙酸乙腈、6g無水硫酸鎂、1.5 g無水醋酸鈉及1顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈振蕩1min后以5000r/min離心5min，吸取5mL上清液加入內(nèi)含900mg無水MgSO4、50mg C18和50mg PSA的離心管中，渦旋混勻1min，以5000r/min離心5min。準(zhǔn)確吸取3mL上述離心后的上清液于10mL試管中，于40℃氮?dú)獯抵两?，用丙酮－正己烷?∶1）定容至1mL，加入10μL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲溶解30s，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，待測定。

1.2.3 氣相色譜條件 色譜柱：TG－5silMS氣相色譜柱（30mm×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：50℃保持1min，以30℃/min升至130℃，再以6℃/min升至280℃，最后以10℃/min升至310℃，保持5min；載氣：高純氦氣（純度≥99.999 %）；流速：1.30 mL/min，恒流；進(jìn)樣口溫度：290℃；進(jìn)樣量：1μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，1.5 min后打開分流閥。

1.2.4 質(zhì)譜條件離子源：電子轟擊源（EI）；離子源溫度：250℃；四極桿溫度：150℃；GC－MS/MS接口溫度：280℃。溶劑延遲時(shí)間：10min；碰撞氣為氬氣，流速1.5 mL/min，猝滅氣為氦氣（He），流速2.25 mL/min。多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（T－MRM），每個(gè)農(nóng)藥選取2對(duì)特征MRM反應(yīng)，其中一個(gè)作為定量離子對(duì)，一個(gè)作為定性離子對(duì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

由于考察農(nóng)藥覆蓋了有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、雜環(huán)類等極性和溶解度差異較大的多種類農(nóng)藥，要求提取溶劑對(duì)目標(biāo)物具有足夠的溶解性和穩(wěn)定性。因此，實(shí)驗(yàn)比較了乙腈、丙酮、丙酮+乙酸乙酯、丙酮+正己烷4組試劑對(duì)232種農(nóng)藥的提取效率（表1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用丙酮、丙酮+正己烷提取時(shí)，部分農(nóng)藥回收率低；用丙酮+乙酸乙酯提取時(shí)，脂溶性雜質(zhì)較多，提取液顏色較深，不利于后續(xù)凈化。乙腈滲透性強(qiáng)，適用于提取極性范圍較寬的農(nóng)藥，對(duì)乳制品中脂類雜質(zhì)提取效率低，并可迅速沉淀蛋白，對(duì)于牛奶、羊奶等含水量較高的樣品可直接提取；但對(duì)于含水量較低的乳粉等樣品，采用乙腈直接提取時(shí)的平均回收率低于60%，因此需在提取前加水浸泡，促使樣品溶脹，提高提取效率；同時(shí)加入乙酸酸化，避免百菌清、異菌脲、苯線磷等堿性或中性環(huán)境下不穩(wěn)定農(nóng)藥的降解和損失［16］。由于百菌清結(jié)構(gòu)式中的甲腈基團(tuán)與樣品基質(zhì)相互作用［17］，導(dǎo)致回收率偏低，加入少量乙酸可破壞這種作用力，從而提高回收率。實(shí)驗(yàn)考察了乙酸體積分?jǐn)?shù)分別為0.5 %、1%、2%、5%對(duì)目標(biāo)物提取效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)乙酸體積分?jǐn)?shù)為0.5 %時(shí)，目標(biāo)物的提取率偏低，當(dāng)乙酸體積分?jǐn)?shù)為1%、2%和5%時(shí)均可獲得較高的提取率，但隨著乙酸體積分?jǐn)?shù)的增加，其他共萃取質(zhì)子化的概率也會(huì)增加，不利于樣品凈化。因此，選取1%乙酸乙腈為提取溶劑。采用渦旋混勻提取乳粉樣品時(shí)，難以破壞蛋白沉淀層致使提取不完全，且無水硫酸鎂遇水易結(jié)塊，加入陶瓷均質(zhì)子可避免無水硫酸鎂結(jié)塊影響除水效果和消除因沉淀包裹目標(biāo)物造成的回收率降低。陶瓷均質(zhì)子兩側(cè)為斜切面的圓柱體，可在振蕩過程中通過剪切力將樣品和結(jié)塊的無水硫酸鎂進(jìn)一步切碎混勻，增大了樣品和提取溶劑的接觸面積，提高了提取效率。

表1 不同提取溶劑對(duì)牛奶中232種農(nóng)藥的添加回收率統(tǒng)計(jì)（n=3）Table1 Spiked recoveries of232pesticides in milk extract with different extraction solvents（n=3）

2.2 凈化條件的優(yōu)化

乳及乳制品基質(zhì)比較復(fù)雜，含有大量脂肪、蛋白質(zhì)和磷脂，乳粉中還含有大量的糖，且方法涉及農(nóng)藥種類及數(shù)量較多，因此需去除蛋白質(zhì)、脂肪等干擾物［17］。盡管脂肪不溶于乙腈提取劑，但提取過程中仍會(huì)攜帶出少量脂肪。QuEChERS方法常用的凈化劑有PSA、C18、GCB、無水MgSO4等。無水MgSO4可以去除提取液中的水分，但提取后直接加入會(huì)立即劇烈放熱，不利于熱不穩(wěn)定農(nóng)藥的檢測，加完后立即劇烈振蕩可減少結(jié)塊和放熱對(duì)提取效率的影響。PSA可去除樣本基質(zhì)中的脂肪酸、糖等極性雜質(zhì)，C18能吸附基質(zhì)中部分非極性脂肪和脂溶性雜質(zhì)，GCB能夠去除色素和固醇類雜質(zhì)，但對(duì)百菌清、六氯苯等平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥具有一定的吸附［18］，實(shí)驗(yàn)參考了食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB23200.113－2018［19］，對(duì)凈化步驟進(jìn)行了優(yōu)化，最終選定PSA、C18和無水MgSO4為凈化劑。考察了不同配比的PSA和C18的凈化效果。取1.5 mL提取液，固定加入20mg PSA，分別比較了C18添加量為10、30、50、70mg對(duì)回收率的影響，發(fā)現(xiàn)C18添加量為50mg時(shí)各農(nóng)藥的回收率最高；固定加入50mg C18，分別比較了PSA添加量為10、30、50、70mg對(duì)回收率的影響，發(fā)現(xiàn)PSA添加量為50mg時(shí)各農(nóng)藥的回收率最高。因此，實(shí)驗(yàn)最終選擇向提取液中加入900mg無水MgSO4、50mg C18和50mg PSA，并立即渦旋振蕩1min。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

對(duì)232種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在m/z30～500范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描，使用NIST標(biāo)準(zhǔn)庫匹配檢索，確定目標(biāo)物的保留時(shí)間，并對(duì)目標(biāo)物的前級(jí)離子、產(chǎn)物離子、碰撞能量等一系列質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。與傳統(tǒng)的多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）相比，T－MRM可對(duì)每種組分的保留時(shí)間窗口進(jìn)行動(dòng)態(tài)分配，檢測多種目標(biāo)物無需分時(shí)間段，可簡化分析流程，提高分析效率，適合進(jìn)行農(nóng)藥多殘留分析。圖1為優(yōu)化條件下232種農(nóng)藥的總離子流（TIC）圖。

圖1 232種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的TIC圖Fig.1 TIC chromatogram of232pesticides in two groups

2.4 內(nèi)標(biāo)的選擇

為了提高方法的準(zhǔn)確度、保持良好的重復(fù)性，盡可能地減少或消除儀器操作條件造成的系統(tǒng)誤差，以及消除EI源在離子化過程中的變化，采用內(nèi)標(biāo)法定量。內(nèi)標(biāo)應(yīng)與待測組分基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)，在分析過程中有良好的穩(wěn)定性，且具有較高的質(zhì)譜響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)考察了環(huán)氧七氯、多氯聯(lián)苯（PCB198）、磷酸三苯酯作為內(nèi)標(biāo)對(duì)定量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以環(huán)氧七氯為內(nèi)標(biāo)時(shí)效果最好，且具有很好的穩(wěn)定性和較高的質(zhì)譜響應(yīng)［9，19－22］，因此選擇環(huán)氧七氯為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（ME，%）=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率－1）×100%，ME小于20%為弱基質(zhì)效應(yīng)；ME在20%～50%范圍內(nèi)為中等基質(zhì)效應(yīng)；ME大于50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)［23－24］，232種農(nóng)藥在不同乳品中的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果如圖2所示。由圖可見，不同樣品基質(zhì)中，至少有60%的分析物響應(yīng)信號(hào)增強(qiáng)，固體乳品中農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)普遍大于液體乳品，其中，奶粉基質(zhì)對(duì)31%的農(nóng)藥表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，即72種農(nóng)藥的ME均大于50%。這是由于同一目標(biāo)物在不同基質(zhì)中基質(zhì)效應(yīng)的大小不同所致，因此需使用與測定樣品基質(zhì)相一致的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正。由于基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生原因復(fù)雜、來源多樣，因而難以根本去除基質(zhì)效應(yīng)的影響［25］。目前，減少基質(zhì)效應(yīng)影響的方法一般有加入同位素標(biāo)記的目標(biāo)物，增加凈化步驟或進(jìn)樣前稀釋，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，分析物保護(hù)劑的加入等［4，26－28］。本方法采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，能夠很好地解決峰形較寬，保留時(shí)間漂移的問題，基本抵消了基質(zhì)效應(yīng)的干擾。

圖2 232種農(nóng)藥（20μg/kg）在不同乳品中的基質(zhì)效應(yīng)Fig.2 Matrix－effects of232pesticides（20μg/kg）in different milk products

2.6 線性關(guān)系、定量下限、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

實(shí)驗(yàn)選取空白牛奶、羊奶、奶粉、酸奶、原料奶和奶酪樣品基質(zhì)的提取液（按“1.2.2”方法制備），配制不同質(zhì)量濃度的農(nóng)藥基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以環(huán)氧七氯為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，嘧菌環(huán)胺在0.2 ～4.0 μg/L，殺撲磷、氯丹、六六六和滴滴涕在0.5 ～10.0 μg/L，丙硫菌唑、七氯、艾氏劑、苯線磷、狄氏劑、異狄氏劑在1.0 ～20.0 μg/L，百菌清在20～400μg/L，其余212種農(nóng)藥在5～100μg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99。按照組分的T－MRM離子峰信噪比S/N≥10，得到乳制品中232種農(nóng)藥的定量下限（LOQ）為0.0004 ～0.05 mg/kg，除百菌清LOQ為0.05 mg/kg，其他農(nóng)藥LOQ均不高于0.01 mg/kg，滿足GB2763－2019的限量要求。

在陰性牛奶樣品中分別添加0.01 、0.02 、0.10 mg/kg的232種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，靜置30min，待農(nóng)藥被樣品充分吸收后，按“1.2.2”方法處理并進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。結(jié)果表明，232種農(nóng)藥在牛奶中的平均回收率為65.2%～110%，RSD為3.6 %～13%，完全滿足國內(nèi)外對(duì)乳品檢測的要求。

表2 232種農(nóng)藥的保留時(shí)間、離子對(duì)、相關(guān)系數(shù)（r）、定量下限（LOQ）、平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table2 Retention times，characteristics ions，correlation coefficients（r），LOQs，average recoveries（R）and RSDs（n=6）of the232pesticides

(續(xù)表2)

(續(xù)表2)

(續(xù)表2)

(續(xù)表2)

2.7 實(shí)際樣品檢測

將建立的方法應(yīng)用于市售280批次乳制品（包括90批次原料奶、70批次牛奶、10批次羊奶、62批次酸奶、40批次奶粉和8批次奶酪）中232種農(nóng)藥殘留的監(jiān)測，結(jié)果在4份原料奶檢出六六六，含量為1.7 ～7.6 μg/kg，7份原料奶檢出滴滴涕，含量為1.3 ～4.8 μg/kg，其它農(nóng)藥均未檢出。根據(jù)GB2763－2019奶中六六六和滴滴涕的殘留限量均≤0.02 mg/kg，表明二者殘留量較低，未超過國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)限值。

由于有機(jī)氯農(nóng)藥被降解需30年之久，原料乳中仍偶有檢出，因此，乳品中農(nóng)藥殘留仍需得到足夠重視，進(jìn)行長期監(jiān)測。

3 結(jié) 論

本文對(duì)乳制品中農(nóng)藥多殘留的前處理方法和檢測技術(shù)進(jìn)行了深入研究，采用QuEChERS法結(jié)合氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜建立了一種簡單、快速、高效且能同時(shí)準(zhǔn)確定性和定量檢測乳制品中232種農(nóng)藥殘留的方法。該方法涵蓋農(nóng)藥種類全，同時(shí)對(duì)不同種類的樣品基質(zhì)進(jìn)行考察，進(jìn)一步加強(qiáng)了方法的適用性，且定量下限同時(shí)滿足國家標(biāo)準(zhǔn)和歐盟等國家和地區(qū)的檢測要求，為乳制品的日常檢測提供了有力的技術(shù)支持。