孫 琛 朱青青 王佳瓊 張 雪

2000年Gronthos［1］等最先從人牙髓組織中分離培養(yǎng)出牙髓干細胞，從此關于牙齒發(fā)育、損傷修復及再生機制方面的認知程度進一步加深，并上升到細胞層面。在這一背景下，牙髓干細胞等牙源性干細胞用于體內外組織重建勢在必行，這是因為人牙髓干細胞有自我更新、多向分化等潛能，有助于牙髓-牙本質復合體形成［2,3］。富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）中的生長因子可誘導多種細胞增殖、分化［4］。體外研究發(fā)現(xiàn)，PRF 能夠誘導兔半月板細胞增殖，促進細胞外基質合成［5］。已有研究指出PRF 在牙周和軟組織修復中起重要作用，但PRF 對人牙髓干細胞成骨分化作用報道少見［6］。本旨在分析PRF 對牙髓干細胞成骨分化的作用及機理，為牙髓干細胞和PRF 的應用提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、血液來源 收集本院20歲左右年輕志愿者，因正畸拔除的健康完整恒牙10 顆，并提取牙髓干細胞，純化擴增。志愿者均為無吸煙、飲酒史的健康男性，各取靜脈血4mL。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理學委員會審批。

1.1.2 主要藥物與試劑α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（武漢普諾賽生物公司），反轉錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司），鼠抗人CD29-PE、CD90-PE、STRO-1-APC單克隆抗體、兔抗人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（Bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、Smad1、Smad5、p-Smad1/5、Runt 相關轉錄因子2（Runt-related tranion factor 2，RUNX2）多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗（日本TaKaRa），BMP 抑制劑LDN-212854、BMP 激活劑山金車內酯C（美國MedChemExpress），堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）試劑盒（上海晶抗生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 牙髓干細胞培養(yǎng) 用改良組織塊-消化聯(lián)合法培養(yǎng)牙髓干細胞，步驟：取出牙髓，PBS 沖洗2 遍，切成小塊，加0.25%胰蛋白酶消化0.5h，離心棄上清，細胞重懸后繼續(xù)培養(yǎng)。細胞匯合率為80%時傳代。

1.2.2 PRF 的制備 按照Li 等［4］的方法制備PRF。取靜脈血，1500r/min離心10min（離心半徑8cm），分離血漿和血細胞之間白色PRF 凝塊，排出多余液體，用2片無菌玻璃片擠壓使PRF 凝塊形成膜狀，滲出液1500r/min 離心10min（離心半徑8cm），獲得無血細胞的滲出液，用無菌過濾器過濾，儲存于-80℃冰箱中待用。

1.2.3 流式細胞儀檢測牙髓干細胞表面抗原標記物 取傳代培養(yǎng)至第3 代的牙髓干細胞，制成單細胞懸液，PBS 重懸細胞，加鼠抗人CD29-PE、CD90-PE、STRO-1-APC，兔抗鼠IgG-APC 為陰性對照，4℃避光孵育1h，重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

1.2.4 分組及處理 牙髓干細胞隨機分為對照組、PRF 組、激活劑組和抑制劑組。對照組牙髓干細胞用含10%胎牛血清的雙抗α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；PRF 組在10%胎牛血清的雙抗α-MEM 培養(yǎng)基中加入-80 ℃保存的PRF，使PRF 體積分數(shù)為50%；激活劑組和抑制劑組在PRF 組培養(yǎng)基基礎上分別加入山金車內酯C（終濃度為10μM）和LDN-212854（終濃度為5nM）。

1.2.5 堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）活性檢測 取對數(shù)生長期的牙髓干細胞，對照組、PRF 組、激活劑組和抑制劑組加入對應的培養(yǎng)基，培養(yǎng)7d、14d 后，加Triton X-100，4℃過夜，細胞完全裂解后加ALP 底物混合液孵育0.5h，0.5mol/L NaOH 終止反應，用酶標儀測定490nm處光密度（A）值。

1.2.6 RT-qPCR 檢測人牙髓干細胞成骨分化 標 志 物 膠 原 蛋 白I（collagen-I，COL-I）、RUNX2、骨鈣素（osteocalcin，OCN）表達 提取細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書反轉為cDNA，進行熒光定量PCR，2-△△CT法計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.2.7 茜素紅染色和半定量檢測 取對數(shù)期的牙髓干細胞，轉接到6孔板（1×106個/mL），細胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)至第14d，固定15min，茜素紅染液染色，倒置顯微鏡下觀察。半定量檢測：晾干固定好的細胞，加1mL茜素紅萃取液，在波長562nm外測定A值。

1.2.8 Western-Blot 檢 測BMP2、Smad1、Smad5、p-Smad1/5、RUNX2蛋白相對表達水平

取對數(shù)期的牙髓干細胞培養(yǎng)14d，收集細胞，提取總蛋白，加入SDS-loading buffer，100℃水浴變性，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜，室溫封閉2h，一抗孵育過夜，二抗（1∶4000 稀釋）室溫封閉1h，曝光顯影，計算目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析 SPSS 24.0 統(tǒng)計學軟件分析，計量資料用（±s）表示，符合正態(tài)分布，方差齊，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t 檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 人牙髓干細胞的表型鑒定 CD29、STRO-1、CD90陽性細胞呈陽性表達，見圖1。

圖1 牙髓干細胞鑒定

2.2 人牙髓干細胞ALP活性檢測PRF組、激活劑組、抑制劑組牙髓干細胞培養(yǎng)7d、14d ALP活性高于對照組（P<0.05）；激活劑組牙髓干細胞培養(yǎng)7d、14d ALP活性高于PRF組，抑制劑組牙髓干細胞培養(yǎng)7d、14d ALP活性低于PRF組（P<0.05）；抑制劑組牙髓干細胞培養(yǎng)7d、14d ALP 活性低于激活劑組（P<0.05）；且隨著培養(yǎng)時間增加，對照組、PRF組、激活劑組、抑制劑組ALP活性也在升高（P<0.05）。見表2。

表2 牙髓干細胞ALP活性（±s，n=5）

表2 牙髓干細胞ALP活性（±s，n=5）

注：與對照組比較，aP<0.05；與PRF組比較，bP<0.05；與激活劑組比較，cP<0.05。與培養(yǎng)7d比較，#P<0.05。

組別對照組PRF組激活劑組抑制劑組F值P值7 d 0.07±0.03 0.23±0.04a0.31±0.04ab0.15±0.03abc14.553<0.001 14 d 0.15±0.03#0.30±0.03a#0.37±0.04ab#0.23±0.03abc#12.214<0.001

2.3 人牙髓干細胞COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA 表達 PRF 組、激活劑組、抑制劑組COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA 表達高于對照組（P<0.05）；激 活 劑 組COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA 表達高于PRF 組，抑制劑組COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA 表 達 低 于PRF 組（P<0.05）；抑制劑組COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA表達高于激活劑組（P<0.05）。見表3。

表3 人牙髓干細胞COL-Ⅰ、RUNX2、OCNmRNA表達水平（±s，n=5）

表3 人牙髓干細胞COL-Ⅰ、RUNX2、OCNmRNA表達水平（±s，n=5）

注：與對照組比較，aP<0.05；與PRF組比較，bP<0.05；與激活劑組比較，cP<0.05。

組別對照組PRF組激活劑組抑制劑組F值P值COL-I 0.37±0.06 0.72±0.07a0.91±0.08ab0.53±0.07abc13.222<0.001 RUNX2 0.28±0.05 0.66±0.06a0.87±0.07ab0.47±0.05abc12.876<0.001 OCN 0.46±0.07 1.02±0.09a1.42±0.09ab0.78±0.08abc14.434<0.001

2.4 各組茜素紅染色半定量分析結果與紅色礦化結節(jié)數(shù)目比較 與對照組比較，PRF組、激活劑組和抑制劑組紅色礦化結節(jié)數(shù)目增多（P<0.05）；與PRF 組比較，激活劑組紅色礦化結節(jié)數(shù)目增多（P<0.05），抑制劑組紅色礦化結節(jié)數(shù)目減少（P<0.05）；與激活劑組比較，抑制劑組紅色礦化結節(jié)數(shù)目減少（P<0.05）。見圖2。

圖2 各組礦化結節(jié)形成情況比較（茜素紅×100）

2.5 各組BMP2、Smad1、Smad5、p-Smad1/5、RUNX2 蛋白相對表達水平PRF 組、激活劑組和抑制劑組BMP2、p-Smad1/5、RUNX2 蛋白相對表達量高于對照組，且抑制劑組

表4 茜素紅染色半定量分析結果與紅色礦化結節(jié)數(shù)目（±s，n=5）

表4 茜素紅染色半定量分析結果與紅色礦化結節(jié)數(shù)目（±s，n=5）

注：與對照組比較，aP<0.05；與PRF組比較，bP<0.05；與激活劑組比較，cP<0.05。

組別對照組PRF組激活劑組抑制劑組F值P值A值0.28±0.02 0.66±0.06a1.42±0.09ab0.45±0.03abc389.167<0.001數(shù)目15±6 40±8a112±10ab27±9abc134.970<0.001

表4 BMP2、Smad 1、Smad5、RUNX2蛋白相對表達水平（±s，n=5）

表4 BMP2、Smad 1、Smad5、RUNX2蛋白相對表達水平（±s，n=5）

注：與對照組比較，aP<0.05；與PRF組比較，bP<0.05；與激活劑組比較，cP<0.05。

組別對照組PRF組激活劑組抑制劑組F值P值BMP2 0.54±0.07 0.89±0.09a1.18±0.10ab0.39±0.08abc85.760<0.001 Smad1 1.01±0.10 1.02±0.11 1.00±0.10 1.01±0.10 0.158 0.878 Smad5 1.21±0.12 1.20±0.12 1.19±0.12 1.20±0.12 0.316 0.760 p-Smad1/5 0.35±0.06 0.68±0.07a0.91±0.09ab0.22±0.07abc91.473<0.001 RUNX2 0.29±0.04 0.70±0.08a0.90±0.09ab0.13±0.02abc153.899<0.001

圖3 BMP2、Smad1、Smad5、RUNX2蛋白相對表達水平

3.討論

Ferrarotti等［7］、Li等［8］、Fuji等［9］研究表明，在一定環(huán)境下，牙髓干細胞可憑借類似骨髓基質干細胞的多向分化潛能，分化為骨、肌肉等組織細胞。PRF富含多種與組織修復相關的生長因子，在牙周和軟組織修復中也起重要作用，因此研究PRF對牙髓干細胞成骨分化的作用對口腔科學的發(fā)展至關重要［10,11］。

CD29、STRO-1、CD90能促進干細胞增殖［12］。本研究中，STRO-1、CD29、CD90陽性表達，表明本研究分離培養(yǎng)的牙髓干細胞符合其表型。ALP反映成骨細胞分化程度，并能促進骨基質礦化形成［13,14］。Matsui等［15］研究表明，干細胞分化程度與ALP活性成正比。有研究發(fā)現(xiàn)，使用根尖乳頭干細胞內加入PRF后，ALP等成骨標志物表達明顯上調［16］。本研究中PRF組與對照組比較，ALP活性明顯升高，礦化結節(jié)數(shù)目增多，提示PRF可誘導成骨細胞分化。黃奕智等［17］發(fā)現(xiàn)用PRF處理牙周膜成纖維細胞，對細胞增殖、成骨細胞分化均有誘導作用。COL-Ⅰ、RUNX2、OCN可謂人牙髓干細胞的成骨分化標志物，本研究中，與對照組比較，PRF組人牙髓干細胞COL-Ⅰ、RUNX2、OCN表達明顯升高，提示PRF可促進人牙髓干細胞成骨分化。

BMP是調控生長發(fā)育過程中扮演重要角色的轉化生長因子-β1超家族成員。膜表面的BMP配體結合BMP Ⅰ型和Ⅱ型受體，受體活化后啟動Smad依賴型信號通路，誘導RUNX2 在細胞核內高表達［18,19］。本研究結果提示BMPR2 抑制劑可下調BMPR2-pSmad1/5-RUNX2信號通路，誘導去分化軟骨肉瘤細胞凋亡［20］。本研究中PRF組相較于對照組BMP2、p-Smad1/5、RUNX2 表達明顯升高，但PRF組BMP2、p-Smad1/5、RUNX2表達低于激活劑組又高于抑制劑組，提示PRF是通過激活BMP受體的表達，促進Smad1/5磷酸化，誘導RUNX2表達發(fā)揮作用，從而促進牙髓干細胞向成骨分化。

綜上所述，PRF 可能通過激活BMP2/Smads信號通路促進人牙髓干細胞成骨分化，為口腔科學臨床研究奠定基礎。