李靖巖

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034）

0 引言

先天性白內(nèi)障為一種常見(jiàn)的視力缺陷疾病，多見(jiàn)于嬰幼兒，指出生一年內(nèi)出現(xiàn)的晶體混濁，可引起視力損傷，嚴(yán)重者或失明。該疾病臨床分型復(fù)雜,根據(jù)晶體渾濁形態(tài)、部位的不同可分為前極性白內(nèi)障、后極性白內(nèi)障、全白內(nèi)障、粉塵狀白內(nèi)障及板層白內(nèi)障等。在所有白內(nèi)障病例中，約1/3可遺傳,其中常染色體顯性遺傳（AD）為最常見(jiàn)的遺傳方式，也可見(jiàn)常染色體隱性遺傳（AR），少數(shù)為X連鎖隱性遺傳。遺傳性先天性白內(nèi)障的致病基因復(fù)雜多樣，具有明顯的遺傳異質(zhì)性。目前研究與報(bào)道證實(shí)該病與80余個(gè)基因相關(guān)：如編碼晶狀體蛋白的CRYAA、CRYBB1-3、CRYBA1、CRYGC、CRYGD等 基 因[1-5]；編碼縫隙連接蛋白的GJA3、GJA8等基因[6-7]；編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因PITX3、PAX6等[8-9]，且新的致病基因不斷被篩選出來(lái)。本研究對(duì)一個(gè)先天性核型白內(nèi)障核心家系進(jìn)行了基因捕獲測(cè)序,發(fā)現(xiàn)在家系所有患者均攜帶一晶狀體蛋白基因突變(CRYAB c.59C>G,p.P20R),為該家系的致病突變。

1 材料與方法

1.1 家系材料

家系先證者為男性，17歲，2016年2月初因視力模糊到沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院眼科就診，臨床診斷為先天性核型白內(nèi)障,2周后內(nèi)進(jìn)行人工晶體植入術(shù)，現(xiàn)視力恢復(fù)?；颊呒议L(zhǎng)口述該患兒幼年發(fā)病，1歲發(fā)現(xiàn)患兒視物不清，癥狀隨年齡增長(zhǎng)逐年加重。該患者有一雙胞胎弟弟，癥狀與發(fā)病年齡相似。家系中患兒的母親早期也表現(xiàn)為類似眼部癥狀，已接受人工晶體置換手術(shù)?；純焊赣H未發(fā)現(xiàn)眼部異常癥狀和體征。本研究所涉及所有家系成員外周靜脈血抽取及DNA樣本提取已獲學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理管理委員會(huì)簽署批準(zhǔn)意見(jiàn),且已獲得全體家系成員簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要儀器及試劑

采用美國(guó)Qiagen 公司生產(chǎn)的血樣DNA提取試劑盒從外周血中提取基因組DNA。用于一代測(cè)序驗(yàn)證所用引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，包裝液濃度為100 μmol/L，十倍稀釋成工作液，濃度為10 μmol/L。dNTP 混合液（4種堿基各2.5mmol/L）為大連寶生物公司生產(chǎn)。DNA聚合酶及配套反應(yīng)緩沖液購(gòu)自大連寶生物公司：TaKaRa rTaq（5 U/μl），配套使用10×PCR Buffer（Mg2+Plus）。

1.3 基因突變篩查

查閱OMIM（http://www.omim.org/）及Pubmed最新文獻(xiàn)報(bào)道，確定81個(gè)單純性及綜合征性先天性白內(nèi)障相關(guān)基因外顯子及側(cè)翼20bp序列和轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)為目的捕獲區(qū)域，提交Life Technologies 公司進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。81個(gè)單純性及綜合征性先天性白內(nèi)障相關(guān)基因見(jiàn)表1。

表1 先天性白內(nèi)障高通量測(cè)序Panel基因列表

1.4 觀察指標(biāo)

根據(jù)Life Technologies公司回報(bào)的可疑基因突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，利用NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)并排除SNP可能性后,初步確定該家系致病基因突變，并針對(duì)該突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，對(duì)該核心家系中所有成員和100位正常人DNA樣本進(jìn)行包含突變位點(diǎn)基因短序列的PCR擴(kuò)增，隨后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger DNA測(cè)序驗(yàn)證,判斷突變與家系表型是否共分離。利用人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（HGMD）查詢檢測(cè)到的致病基因突變是否為已報(bào)道突變或全新突變位點(diǎn)。

1.5 分析軟件及常用數(shù)據(jù)庫(kù)

1.5.1 基因組序列信息數(shù)據(jù)庫(kù)

NCBI database（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），UCSC Genome（http://www.genome.ucsc.edu/）

1.5.2 引物設(shè)計(jì)軟件

Primer Premier 6.0

1.5.3 DNA測(cè)序峰圖查看軟件

Chromas 2.0

1.5.4 已報(bào)道疾病相關(guān)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)

The Human Gene Mutation Database（HGMD）(http://www.hgmd.cf.ac.uk/)，Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）(http://www.omim.org/)。

2 結(jié)果

Ion AmpliseqTM 二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)，家系中兩個(gè)患兒及患兒母親的DNA樣本在CRYAB基因1號(hào)外顯子第59位堿基均發(fā)生了C>G雜合突變（圖1）,導(dǎo)致該基因編碼的αB晶體蛋白第20位氨基酸殘基由精氨酸取代了原有的脯氨酸，家系中表型正常的患兒父親和100例表型正常對(duì)照者中均未有該突變檢出。另外,在NCBI、UCSC等相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)存在相同的SNP，排出了單核苷酸多態(tài)性可能。通過(guò)查詢?nèi)祟惢蛲蛔償?shù)據(jù)庫(kù)（HGMD）證實(shí)，該點(diǎn)突變?yōu)橐褕?bào)道突變，可導(dǎo)致不同臨床類型的先天性白內(nèi)障的發(fā)生。利用NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)該突變位點(diǎn)氨基酸序列的保守性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示P20位點(diǎn)在各物種具有高度保守性（圖2）。

圖1.家系患者CRYAB基因Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

圖2.αB晶體蛋白在P20位點(diǎn)的氨基酸序列高度保守

3 討論

晶體蛋白主要包括α、β、γ三類，編碼晶體蛋白的基因主要有CRYAA、CRYAB、CRYBA1-4、CRYCC、CRYDD、CRYGA、CRYGB、CRYGC、CRYGD等。晶體蛋白基因突變不僅導(dǎo)致其編碼蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)異常,還會(huì)降低晶體蛋白的溶解性而導(dǎo)致晶體混濁。

Liu等[10]在2006年報(bào)道，P20S突變可導(dǎo)致先天性后極性白內(nèi)障。αB晶體蛋白是晶狀體中重要的蛋白組分，屬熱休克蛋白，是從低等生物如細(xì)菌，到高等哺乳動(dòng)物普遍存在的一種熱應(yīng)激性蛋白。機(jī)體處于高溫時(shí)，機(jī)體會(huì)被激發(fā)合成此種蛋白。許多熱休克蛋白具有分子伴侶作用，可指導(dǎo)與協(xié)助晶體蛋白空間構(gòu)像的正確折疊。αB晶體蛋白突變還可能影響其與αA晶體蛋白相互作用，從而引起顯性負(fù)效應(yīng)，導(dǎo)致患兒在晶體發(fā)育早期形成白內(nèi)障。另外，αB晶體蛋白突變還可導(dǎo)致其抑制晶體上皮細(xì)胞凋亡功能受損,從而導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生。

本研究中發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變位于CRYAB基因，該基因編碼αB晶體蛋白，位于11號(hào)染色體，D11S4176-D11S908區(qū)域，含3個(gè)外顯子。αB晶體蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)全長(zhǎng)175個(gè)氨基酸，其中P20位點(diǎn)在各物種間高度保守,表明該位點(diǎn)編碼的氨基酸在維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)像和功能方面具有重要意義。

由于αB晶體蛋白與αA晶體蛋白可相互作用，所以我們推測(cè)，攜帶P20S突變的αB晶體蛋白可能以顯性負(fù)效應(yīng)的方式作用干擾αA晶體蛋白，從而導(dǎo)致攜帶該突變的患者在胚胎發(fā)育早期發(fā)生晶體蛋白排列干擾，進(jìn)而導(dǎo)致晶體透明度下降。另外，突變?chǔ)辆w蛋白不再具有調(diào)控晶體上皮細(xì)胞凋亡的功能，導(dǎo)致晶體上皮細(xì)胞正確排列受到干擾，引起晶體透明度的下降。Li H等的報(bào)告也證實(shí)了白內(nèi)障引起P20S突變?chǔ)罛晶體蛋白對(duì)其伴侶活性的影響α晶體蛋白與人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡[11]。近期研究表明，P20S突變導(dǎo)致了αB晶體蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而影響該蛋白的二級(jí)空間結(jié)構(gòu)，可增加α-螺旋和減少β-片層結(jié)構(gòu)，同時(shí)三級(jí)結(jié)構(gòu)也可發(fā)生變化，從而影響蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性和空間構(gòu)象，誘導(dǎo)聚集體的形成[12]。我們推測(cè)，P20R突變還可能改變了該蛋白的親水性和等電點(diǎn)，導(dǎo)致突變蛋白的溶解度降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)自聚集，并引發(fā)更穩(wěn)定的αA晶體蛋白雜合多聚體。此外，該突變還可能影響到αA晶體蛋白的分子伴侶功能，從而進(jìn)一步促進(jìn)患者白內(nèi)障的發(fā)展。

本研究采用的基因突變篩查技術(shù)主要為基于illumina平臺(tái)的二代測(cè)序技術(shù)。第二代DNA測(cè)序技術(shù)是對(duì)第一代測(cè)序技術(shù)的劃時(shí)代變革。第一代測(cè)序技術(shù)具有高達(dá)99.999% 的準(zhǔn)確率，但不足之處是測(cè)試速度慢、通量低、成本高昂等。以往的致病基因連鎖分析及一代DNA測(cè)序策略在面對(duì)大量的患者DNA樣本或遺傳規(guī)律復(fù)雜、致病基因譜巨大的突變基因篩查工作時(shí)，往往無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)得到有效、精確、科學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，第二代DNA測(cè)序技術(shù)，又被稱為高通量測(cè)序技術(shù)，以低成本、高準(zhǔn)確度、高通量等優(yōu)勢(shì)成為先天性基因突變篩查的主流技術(shù)，特別適用于致病基因譜龐大、遺傳規(guī)律復(fù)雜的先天性遺傳病的致病基因突變篩查。

目前，DNA分子測(cè)序技術(shù)又迎來(lái)了第三代，發(fā)明人是Stephen W Turner博士和Jonas Korlach博士。測(cè)序技術(shù)經(jīng)過(guò)前面的發(fā)展，單次測(cè)序讀取長(zhǎng)度從Sanger測(cè)序時(shí)代的1000bp，降到了高通量測(cè)序時(shí)代的幾百bp，到了三代測(cè)序技術(shù)又擁有了超長(zhǎng)的讀取長(zhǎng)度，通量和速度都得到了大幅提升。它彌補(bǔ)了前兩代測(cè)序技術(shù)中諸多缺點(diǎn)，如讀長(zhǎng)短、受目標(biāo)片段GC含量影響大等局限。三代測(cè)序最大的優(yōu)勢(shì)點(diǎn)是可以進(jìn)行單分子測(cè)序，即實(shí)驗(yàn)者在測(cè)序過(guò)程無(wú)需對(duì)測(cè)序目標(biāo)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第三代基因測(cè)序最大讀取長(zhǎng)度得到了有效增加，可以大大減少拼接成本，從而節(jié)省試劑消耗和操作步驟。由于該測(cè)序技術(shù)無(wú)需PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段，因此避免了由于反復(fù)大量的DNA復(fù)制引入的堿基復(fù)制錯(cuò)誤，造成假陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第三代測(cè)序技術(shù)還可拓展應(yīng)用于甲基化DNA序列測(cè)序、RNA序列測(cè)序以及其他微量樣本測(cè)序等。第三代測(cè)序技術(shù)的一個(gè)亮點(diǎn)在于甲基化DNA序列測(cè)序。測(cè)序過(guò)程中DNA聚合酶復(fù)制四種堿基的速度是不一樣的，正常的堿基或者發(fā)生甲基化的堿基為模板，DNA聚合酶停頓的時(shí)間也是不同的。系統(tǒng)根據(jù)時(shí)間的不同，可以判斷模板的堿基是否甲基化。三代測(cè)序缺陷也具有一定缺陷，如單讀長(zhǎng)的錯(cuò)誤率偏高、為糾錯(cuò)發(fā)生的重復(fù)測(cè)序增加了不必要的測(cè)序成本、對(duì)DNA聚合酶的活性有嚴(yán)格要求以及整體實(shí)驗(yàn)成本較高等。

隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，我們相信層出不窮的DNA測(cè)序技術(shù)會(huì)實(shí)現(xiàn)更簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)操作，達(dá)到更精確、更快捷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，會(huì)成為遺傳病致病基因突變篩查的有力工具。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)一個(gè)先天性核型白內(nèi)障核心家系DNA樣本進(jìn)行高通量測(cè)序聯(lián)合Sanger測(cè)序,發(fā)現(xiàn)CRYAB c.59C>G，p.P20R為該家系的致病突變。CRYAB基因雜合錯(cuò)義突變可導(dǎo)致先天性核型白內(nèi)障的發(fā)生。