趙忠福，李曉光，鄒德勛，孫蘭春，姚宏波

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006）

0 引言

骨關(guān)節(jié)假體、支架材料等植入物感染給患者帶來嚴(yán)重后果[1]。細(xì)菌耐藥性持續(xù)加劇，生物材料感染率日趨增高[2]。納米銀（Silver nanoparticles，AgNP）能夠釋放Ag2+，抑制微生物或抑制能量傳遞[3]，具有抑制細(xì)菌、真菌和病毒等活性[4]，被應(yīng)用于生物材料、醫(yī)用材料涂層等領(lǐng)域[5]。以AgNPZnO 復(fù)合物在骨科植入物表面涂層，能夠有效降低感染，擴(kuò)大了骨科器械的應(yīng)用，促進(jìn)了醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步[6]。骨髓內(nèi)含有大量骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC），BMSC 能夠分化為骨或軟骨，促進(jìn)骨組織修復(fù)和骨折愈合[7]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BMSC 中添加AgNP，可以促進(jìn)BMSC成骨分化[8]。雖然AgNP 對(duì)BMSC 具有促進(jìn)分化，抑制細(xì)胞感染的作用，但是AgNP 對(duì)BMSCs 增殖或凋亡是否產(chǎn)生影響，還鮮見報(bào)道。闡明AgNP 對(duì)BMSC 增殖、凋亡的影響效果，能夠?yàn)榧{米銀在臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

hBMSCs 購自美國ATCC 公司。α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone 公司；直徑10nm 銀納米溶液、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）均購自Sigma 公司；CCK-8 試劑購自日本同仁公司；Triciribine（Akt 抑制劑）購自美國Selleck 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒等Western blot 試劑購自上海碧云天生物科技有限公司；人Total-SOD 和MDA 的ELISA 試劑盒均購自美國R&D 公司；小鼠抗人Caspase 3 抗體、小鼠抗人GAPDH 抗體和辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 購自英國Abcam 公司。美國Molecular 公司的Spectra Max190 酶標(biāo)儀；美國BD 公司的FACSAria Ⅱ流式細(xì)胞儀；日本Olympus 公司的IX53 型倒置熒光顯微鏡。上海天能科技公司的Tanon 6200 發(fā)光成像分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 BMSC 培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)得到齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。BMSC 用含10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。正常培養(yǎng)條件下，無任何刺激培養(yǎng)的BMSCs 為對(duì)照組，以5μmol/L AgNP 刺激BMSC 則為AgNP 組；若同時(shí)以5nmol/L Triciribine和5μmol/L AgNP 培養(yǎng)的BMSCs 則為Akt 抑制劑組。

1.2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)

1.0×104BMSCs/孔，加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中，37℃，5%CO2培養(yǎng)12h 后，每孔再添加10μL CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4h。Spectra Max190 酶標(biāo)儀在450nm 波長檢測(cè)各組BMSC 的吸光度值（Absorbance value，A 值）。

1.2.3 Western blot

6.5×106各組BMSCs 用RIPA 裂解液裂解。4℃，12000r/min 離心5min，40μg 各組BMSCs 蛋白，100V，經(jīng)SDS-PAGE 電泳90min，轉(zhuǎn)至PVDF 膜；5%脫脂奶粉封閉60min；分別加入小鼠抗人Caspase 3抗體（1:300），小鼠抗人GAPDH 抗體（1:500），4℃孵育18h；加入HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1:400），室溫孵4h；ECL 發(fā)光劑標(biāo)記蛋白條帶，Tanon 6200發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯影，IPP6.0.1 軟件分析蛋白條帶的相對(duì)表達(dá)情況。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

6.5×106各組BMSCs 用RIPA 裂解液裂解。4℃，10000r/min 離心5min，取上清液，人ELISA 試劑盒檢測(cè)各組BMSCs 的Total-SOD、MDA 蛋白的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AgNP 對(duì)BMSCs 增殖的影響

對(duì)照組、AgNP 組、Akt 抑制劑組BMSCs 的A 值分別為（1.68±0.81）、（2.94±0.13）、（1.71±0.44），三組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。AgNP組BMSCs 的A 值是對(duì)照組的1.75 倍（P<0.01），Akt 抑制劑組BMSCs 增殖A 值是AgNP 組的58.16%（P<0.01）。

2.2 AgNP 抑制Caspase 3 蛋白表達(dá)

對(duì)照組、AgNP 組、Akt 抑制劑組BMSCs 的Caspase 3 相對(duì)表達(dá)量分別為（0.89±0.07）、（0.43±0.01）、（1.01±0.20），組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），AgNP 組Caspase 3 蛋白相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的48.33%（P<0.01）。Akt抑制劑組Caspase 3 相對(duì)表達(dá)量是AgNP 組的2.34倍（P<0.05），見圖1。

圖1 Western blot 檢測(cè)各組BMSCs 的Caspase 3 蛋白表達(dá)條帶

2.3 AgNP 對(duì)Total-SOD、MDA 蛋白的影響

對(duì)照組、AgNP 組、Akt 抑制劑組BMSCs 的Total-SOD、MDA 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。AgNP 組BMSC 的Total-SOD、MDA 分別是對(duì)照組的1.57 倍、77.20%（P<0.01）；Akt 抑制劑組Total-SOD、MDA分別是AgNP組的65.38%、1.24倍（P<0.01），見表1。

表1 各組BMSCs 的Total-SOD 和MDA 表達(dá)（，n=18）

表1 各組BMSCs 的Total-SOD 和MDA 表達(dá)（，n=18）

注：*P<0.01，與對(duì)照組比較；#P<0.01，與AgNP 組比較

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，顆粒直徑10nm 的AgNP 能夠形成較大表面積，有利于釋放Ag2+，因此，AgNP 比Ag2+具有更顯著的殺菌或抑菌效果[9]。AgNP 在醫(yī)療植入物表面形成抗微生物涂層，能夠有效防止形成微生物膜[10]。抗微生物植入材料具有出色的生物相容性是臨床應(yīng)用，減少副作用，避免感染的基本前提。為了模擬體內(nèi)炎癥環(huán)境，我們利用CCK-8 實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)照組、AgNP 組和Akt 抑制劑組BMSCs 的增殖情況，相對(duì)于對(duì)照組，AgNP 組的BMSCs 的A 值增高，提示AgNP 促進(jìn)BMSC 增殖能力。這可能由于AgNP 具有較好的抗氧化、抑菌等能力，提高了細(xì)胞表達(dá)抗氧化酶[11]，但是相關(guān)實(shí)驗(yàn)還需要深入驗(yàn)證。AgNP 組Caspase 3 蛋白表達(dá)降低也驗(yàn)證AgNP 對(duì)BMSC 具有抗氧化，抑制自由基損傷功能[12]。為了驗(yàn)證我們的判斷，以ELISA 實(shí)驗(yàn)證明了AgNP 組Total-SOD 蛋白高表達(dá)，Total-SOD 有效抵抗缺氧、炎癥等原因產(chǎn)生的自由基[13]，修復(fù)受損的細(xì)胞膜脂質(zhì)或細(xì)胞內(nèi)DNA 分子，降低細(xì)胞內(nèi)過氧化氫含量，達(dá)到抗自由基逆轉(zhuǎn)組織損傷的效果[14]。此外，研究認(rèn)為，細(xì)胞凋亡時(shí)，丙二醛（MDA）由細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)外翻，是衡量細(xì)胞應(yīng)激嚴(yán)重程度，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷的重要指標(biāo)之一[15]。本實(shí)驗(yàn)的ELISA 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，AgNP 組MDA 表達(dá)水平下降，表明AgNP 在抗自由基損傷中起著重要作用。Akt 抑制劑組Total-SOD 含量降低，MDA 表達(dá)升高的結(jié)果，提示AgNP 能夠通過激活A(yù)kt 信號(hào)通路上調(diào)Total-SOD 表達(dá)。也有研究揭示AgNP 通過Akt-AMPK-mTOR 途徑誘導(dǎo)HC11 細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性自噬氧化應(yīng)激和線粒體膜電位改變，與細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體改變有關(guān)[16]。當(dāng)然，我們并不否定AgNP 除了Akt 途徑外，AgNP 也可能激活Erk[17]、MAPK[18]等信號(hào)通路發(fā)揮作用，關(guān)于AgNP 對(duì)細(xì)胞的分子機(jī)制還需要在今后的細(xì)胞水平和動(dòng)物水平進(jìn)行深入研究。

綜上所述，納米銀通過Akt 通路促進(jìn)表達(dá)Total-SOD，提高BMSCs 增殖，抑制其凋亡。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們將利用炎癥、缺氧等細(xì)胞模型，深入揭示納米銀對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化等影響和分子機(jī)制，以便為納米銀的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。