江一航，肖輝雨，2，曹仲林，3，翟鵬，徐周睿，李麗，鄒曉敏，馬名澤，王曉梅，林桂淼，許改霞

1.深圳大學醫(yī)學部生物醫(yī)學工程學院，廣東深圳518055；2.深圳市藥品檢驗研究院，廣東深圳518057；3.貴州民族大學材料科學與工程學院，貴州貴陽550025；4.深圳大學醫(yī)學部，廣東深圳518055；5.深圳大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院生理學系，廣東深圳518055

前言

腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移的內(nèi)環(huán)境，是由腫瘤細胞、腫瘤相關的成纖維細胞及其周圍的組織、免疫細胞、血管、細胞外基質(zhì)等共同形成的動態(tài)網(wǎng)絡［1-3］。其中，腫瘤新生血管將提供腫瘤組織新陳代謝所必需的氧氣和營養(yǎng)，以促進腫瘤的迅速生長。如果可以清晰觀察腫瘤新生血管的形狀及變化，便可實現(xiàn)腫瘤治療及轉(zhuǎn)移監(jiān)測。腫瘤生長中血管的監(jiān)測和成像對解析和干預腫瘤生長，相關藥物研制、篩選和評價具有重要意義［4-6］。

背脊皮翼視窗（Dorsal Skin Fold Window Chamber,DSFC）是一種小動物活體原位光學成像的輔助工具，通過在小鼠或兔子身上構建可以進行光學成像的透明窗口，拓展成像深度，使腫瘤微環(huán)境的血管、細胞甚至血流狀況得以可視化，大大提高了對病理生理學中微觀血管化的理解［7-10］。Palmer等［11］介紹了DSFC用于活體小鼠光學功能成像的方法，指出視窗模型對于研究活體的基因表達、血管重塑、血管新生以及腫瘤生長和侵襲具有一定的應用價值。2018年，Staresinic等［12］利用DSFC模型評價鈣電穿孔法的抗腫瘤效果，結(jié)果表明，鈣電穿孔法對正常血管和腫瘤局部血管具有相同程度的作用，主要通過破壞血管導致腫瘤壞死。

活體光學成像是一種在亞細胞水平上研究生理和病理過程的無損、微擾的成像方法，已被證明是一種能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤發(fā)展監(jiān)測、腫瘤治療評估的強大工具［13-14］?；铙w光學成像技術具有高分辨率、高靈敏度、可視化、能夠?qū)崟r監(jiān)測等優(yōu)點，但是其成像深度淺，無法在傳統(tǒng)小鼠腫瘤模型中獲得腫瘤微環(huán)境的精確信息。

本研究利用轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）的小鼠乳腺癌細胞（4T1）構建了DSFC 的乳腺癌熒光腫瘤模型，結(jié)合體視熒光顯微鏡和激光散斑成像（Laser Speckle Imaging, LSI）儀，連續(xù)監(jiān)測活體小鼠腫瘤生長及腫瘤局部血管狀態(tài)，同時采集腫瘤面積、體積、血管流量等參數(shù)隨時間的動態(tài)變化數(shù)據(jù)。在此基礎上，評價實驗室前期開發(fā)的抗腫瘤基因納米藥物PCL-PDEM-siRNA［15］對小鼠視窗內(nèi)腫瘤和腫瘤血管的抑制效果，揭示了該藥物對4T1 乳腺腫瘤生長的連續(xù)動態(tài)作用效果。本研究為腫瘤微環(huán)境的精細化成像和定量分析提供了新的策略，對腫瘤生物學的基礎研究和抗腫瘤藥物研發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 細胞實驗

細胞培養(yǎng)液由89%的RPMI-1640 培養(yǎng)液（購買于美國Gibco 公司）加入10%胎牛血清（購買于美國Thermo Scientific 公司）和1% 雙抗（購買于美國Thermo Scientific公司）混合而成，37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中預熱。4T1 細胞系（小鼠乳腺癌細胞，轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP）購于廣州吉妮歐生物科技有限公司。按0.5×104個/孔密度將腫瘤細胞接種在12 孔板，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 裸鼠背脊翼視窗腫瘤模型構建

根據(jù)實驗的要求和目的，實驗動物采用購自于廣東省實驗動物中心6～8 周齡22～25 g 的BALB/c 裸鼠于SPF條件下飼養(yǎng)，目的在于保證植入背脊翼視窗后裸鼠可以進行正常的飲食和作息，有利于實現(xiàn)活體動態(tài)連續(xù)監(jiān)測。本研究中所有的動物手術和實驗操作過程都嚴格遵照深圳大學實驗室設備部和醫(yī)學部動物實驗倫理委員會的規(guī)定。在DSFC 手術和成像過程中，小鼠持續(xù)吸入1.5%異氟醚和30%氧氣以及70%氮氣的混合氣體麻醉，維持核心溫度為37 ℃。如圖1 所示，小鼠麻醉狀態(tài)下實施DSFC 手術，使用縫合線將皮膚固定于視窗框架，視窗玻片直接嵌入皮膚開口處［16-18］。待小鼠生長狀態(tài)穩(wěn)定后，微量進樣針取5.5×105個4T1 細胞從視窗區(qū)域外部皮下注射，將細胞注射在于視窗中央血管交匯處。腫瘤生長至第4天，根據(jù)視窗內(nèi)圖像判斷腫瘤視窗模型是否構建成功，成功模型應用于后續(xù)藥物治療效果動態(tài)成像觀察。

1.3 實驗動物分組及治療

如圖1 所示，對成功構建視窗后的小鼠隨機分為空白組、磷酸緩沖液組、腫瘤組以及納米藥物治療組，每組3～4 只。其中，空白組作為對照不進行任何操作。磷酸緩沖液組在空白組的基礎上第0 天進行磷酸緩沖液注射，旨在研究注射操作對視窗內(nèi)毛細血管血流灌注量的影響。而腫瘤組以及納米藥物治療組均在第0 天開始，在視窗內(nèi)接種4T1 腫瘤細胞，不同的是納米藥物治療組在第4 天開始注射納米藥物PCL-PDEM-siRNA。從第0 天到第18 天持續(xù)對各組進行活體成像。

圖1 實驗動物分組及治療Fig.1 Grouping of experimental mice and the corresponding treatment strategy

1.4 腫瘤尺寸的測量方法

在DSFC腫瘤模型實驗中，我們根據(jù)傳統(tǒng)小鼠腫瘤模型的腫瘤體積計算方法：利用ImageJ軟件讀取明場或熒光圖片上腫瘤的長（L）和寬（W），公式如下：

根據(jù)式（1）計算得到腫瘤的體積。此外，考慮到DSFC腫瘤模型中，腫瘤在垂直于視窗的方向上生長受限，且生長區(qū)域并不規(guī)則，我們也用ImageJ軟件勾選出明場和熒光圖像中腫瘤區(qū)域，對腫瘤的面積進行計算。

1.5 血流灌注量的計算方法

根據(jù)激光散斑成像儀拍攝出的圖像，用軟件自帶微血管管徑測量工具測量感興趣血管的直徑（D）及流速（v）。將感興趣血管直徑的軟件讀數(shù)（R）換算為單位μm，記放大倍數(shù)為M，計算公式如下：

根據(jù)轉(zhuǎn)換得到的D值和軟件讀數(shù)（v）值，計算出單根血管單位時間內(nèi)的灌注量即血流灌注量Q，計算公式如下［19-20］：

1.6 主要實驗儀器

實驗儀器主要包括：臺式高速冷凍離心機（H-1850R, Eppendorf），超凈工作臺（SW-CJ-2FD,Airtech），共聚焦顯微鏡（TCS SP5 II, Leica），二氧化碳培養(yǎng)箱（HERAcell vios 160i, Thermo Fisher Scientific），移動式麻醉機（R520,瑞沃德），熒光分光光度計（Cary Eclipse, Aglien），超純水儀（Milli-Q，Millipore），流式細胞儀（FACS Calibur, BD），熒光顯微 鏡（BX51, OLYMPUS），體視顯微鏡（SZX16,OLYMPUS），激光散斑成像系統(tǒng)（BVI, TEK SQRAY），馬爾文激光粒度儀（Zetasizer-Nano-ZS-90,Malvern Panalytical）。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。實驗組間的數(shù)據(jù)比較采用單方差分析法（ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤視窗模型的構建

首先在小鼠背部構建DSFC 視窗，明場下利用體視顯微鏡觀察視窗內(nèi)是否有水腫、血管是否清晰、邊緣有無出血等；然后將4T1 腫瘤細胞接種到視窗中心，觀察小鼠的進食習慣及行為狀態(tài)，并在接種4 d后在體視顯微鏡下觀察接種區(qū)域局部血管形貌及新生血管情況。

結(jié)果表明，DSFC 術后小鼠狀態(tài)良好，視窗不影響小鼠正常進食和行動。DSFC 構建成功30 min 后，可在體視顯微鏡明場下觀察到視窗內(nèi)血管形態(tài)，血管細長且形狀規(guī)則（圖2b），視窗皮下和邊緣縫合區(qū)無出血無水腫，視窗中央與邊緣厚度均勻。接種4T1細胞后4 d，肉眼可見接種部位隆起增厚，接種點周圍直徑小于20 μm 的毛細血管明顯增多，血管細且彎曲（圖2d），根據(jù)經(jīng)驗判斷4T1 乳腺癌DSFC 小鼠模型已構建成功。重復實驗表明，接種4T1 細胞3～5 d 后，DSFC小鼠成瘤率可達90%以上。

圖2 小鼠DSFC成像Fig.2 Typical images of mouse dorsal skin-fold window chamber(DSFC)

為了連續(xù)、動態(tài)觀察腫瘤及腫瘤微環(huán)境內(nèi)血管的生長情況，我們利用體視顯微鏡對同一腫瘤小鼠視窗進行22 d連續(xù)成像。如圖3所示，接種當天為第0 天，當天視窗內(nèi)血管清晰，接種區(qū)域無水腫；接種第2 天可見接種區(qū)域增厚，局部毛細血管數(shù)量增加，遠端毛細血管變形連接，周邊大血管增粗；從第4 天到第22天，顯微鏡可下觀察到腫瘤區(qū)域逐步增厚擴大，部分靠近接種區(qū)域的血管因與腫瘤位置重疊已無法觀測，腫瘤周邊的毛細血管增多、變粗。

圖3 體視顯微鏡下第0～22天腫瘤生長變化（標尺為2 mm）Fig.3 Tumor growth observed under stereomicroscope from day 0 to day 22(Scale bar:2 mm)

2.2 腫瘤視窗活體動態(tài)成像

為了進一步研究該視窗在腫瘤藥物療效中的功能，我們選擇實驗室前期開發(fā)的抗腫瘤基因納米藥物PCL-PDEM-siRNA 對視窗內(nèi)腫瘤進行治療，利用熒光體視顯微鏡和激光散斑成像儀，對視窗內(nèi)血管形態(tài)、腫瘤尺寸、血流灌注量等參數(shù)進行持續(xù)動態(tài)監(jiān)測，從而研究該納米藥物的抗腫瘤特性。

首先在體視顯微鏡明場下觀察各組實驗小鼠視窗內(nèi)的血管形態(tài)，并定量分析視窗內(nèi)腫瘤的面積和體積，如圖4 所示。圖4 顯示的是典型的體視顯微鏡明場成像結(jié)果：由圖4a 可見，空白組血管形態(tài)、數(shù)量隨時間延長均無明顯變化；磷酸緩沖液組注射區(qū)域在第8 天出現(xiàn)直徑900 μm 的小片陰影，且陰影區(qū)域毛細血管增多，在第12 天，陰影區(qū)域變淡減小，而毛細血管繼續(xù)增多變粗。而在第16 天，陰影區(qū)域完全消失，血管形態(tài)恢復到第4 天的狀態(tài)，推測是針頭注射引起的短暫炎癥，炎癥發(fā)生在針頭注射的第4～8天。

腫瘤視窗模型在接種4T1 腫瘤細胞第4 天后分為2 組，觀察PCL-PDEM-siRNA 藥物對腫瘤的抑制作用。由圖4a后兩行圖像可見，與腫瘤組相比，納米藥物治療組在第8天開始腫瘤區(qū)域停止增大，血管形態(tài)基本穩(wěn)定且毛細血管的數(shù)量開始減少，也沒有出現(xiàn)遠端毛細血管連接、血管向腫瘤部位收縮的現(xiàn)象。為準確把握腫瘤的變化情況，我們對腫瘤組和納米藥物治療組的腫瘤面積與體積進行定量分析。圖4b是利用傳統(tǒng)腫瘤計算公式計算得到的腫瘤體積變化趨勢圖，可見納米藥物治療組在第8 天后，可以抑制腫瘤細胞生長，從而使腫瘤的尺寸維持在一定范圍內(nèi)不變化；考慮到DSFC 視窗模型會使腫瘤縱向生長受限，我們同時也對視窗內(nèi)腫瘤面積進行計算，如圖4c 所示，腫瘤面積的變化與體積變化總體趨勢是相同的，納米藥物治療組的明顯腫瘤抑制效應發(fā)生在藥物注射后第4天。

為避免手動劃分腫瘤區(qū)域的人為誤差，我們對腫瘤視窗區(qū)域進行熒光成像，利用4T1細胞轉(zhuǎn)染的綠色熒光蛋白，可以清晰勾勒出腫瘤生長情況（圖5）。由圖5 可知，在腫瘤組接種腫瘤細胞后第4 天可觀察到邊界清晰的腫瘤形態(tài)；第8天腫瘤組的腫瘤尺寸持續(xù)增大，綠色的腫瘤區(qū)域內(nèi)部出現(xiàn)黑色的管狀結(jié)構為無熒光的新生血管；相對于第4天的注射納米藥物治療組，第8 天的治療組的腫瘤也增大，但腫瘤內(nèi)部新生血管的數(shù)量明顯少于腫瘤組；第12 天腫瘤組的腫瘤繼續(xù)增大，腫瘤內(nèi)部的新生血管數(shù)量增多且更為粗大，而納米藥物治療組的腫瘤尺寸與第8天無顯著差別，腫瘤內(nèi)血管數(shù)量和形態(tài)維持穩(wěn)定；第16天腫瘤組的腫瘤大小繼續(xù)增大，腫瘤內(nèi)部血管數(shù)量繼續(xù)增加，中央細胞熒光強度明顯減弱，推測中央?yún)^(qū)域發(fā)生細胞壞死；而納米藥物治療組的腫瘤尺寸在藥物注射第4天后就不再增加，腫瘤內(nèi)部新生血管數(shù)量和形態(tài)無明顯變化。對腫瘤區(qū)域的體積和面積的定量計算如圖5b 和圖5c 所示，納米藥物治療組的腫瘤體積及面積從第8天開始趨于穩(wěn)定，不再變化。該結(jié)果與熒光定性分析的結(jié)果一致，也與圖4明場分析的結(jié)果一致。

圖4 腫瘤生長變化圖（標尺為2 mm）Fig.4 Typical stereomicroscope images and tumor growth curves(Scale bar:2 mm)

由圖5可知，視窗內(nèi)熒光圖像的形狀和明場圖像的形狀不完全一致。明場下腫瘤區(qū)域大多為圓形，熒光圖像下則不是，而且治療后的形狀則更加不規(guī)則。此外，由于腫瘤附近和腫瘤內(nèi)部的血管及血流灌注量是反應腫瘤微環(huán)境的重要指標，我們利用激光散斑成像儀，對腫瘤視窗內(nèi)血流灌注量也進行了定量分析。

圖5 腫瘤生長變化熒光圖（標尺為2 mm）Fig.5 Fluorescence images and tumor growth curves(Scale bar:2 mm)

圖6a 散斑成像可清晰分辨小鼠DSFC 區(qū)域內(nèi)血流灌注量及輪廓。第4～8天，腫瘤組視野中心的信號明顯變紅，表明腫瘤附近區(qū)域的血流速度有了顯著性提高；第8～12 天，小鼠DSFC 區(qū)域血流速度進一步加快，附近的毛細血管內(nèi)血流速度也有大幅提高；第12～16 天，腫瘤區(qū)域信號顏色趨于穩(wěn)定，結(jié)合圖6b 定量分析可知血流灌注量依舊增大?？瞻捉M和磷酸緩沖液組的血流速度無明顯波動，但磷酸緩沖液組相較于空白組血流灌注量有明顯提升，考慮兩方面原因：一是磷酸緩沖液的注射增加了局部體液，使血流速度加快；另一方面，可能是針頭對局部的刺激造成了血流灌注量的增加。腫瘤組視窗中心（接種點附近）血流灌注量隨時間明顯增大。而對于納米藥物治療組，藥物注射從第4 天開始，血流灌注量相較于未治療前略微增加，可能是由于藥物注射及針頭刺激引起的，在第6天之后，血流灌注量不再變化，與注射前基本一致，在第8天后，趨于穩(wěn)定。

圖6 小鼠DSFC激光散斑成像圖（標尺為1 mm）Fig.6 Laser speckle imaging of mouse DSFC(Scale bar:1 mm)

綜合以上體視顯微鏡的明場成像、熒光成像以及激光散斑成像數(shù)據(jù)，我們可以明確，抗腫瘤基因納米藥物PCL-PDEM-siRNA 對于4T1 乳腺癌有抑制效果，在藥物注射4 d 后，腫瘤尺寸不再增大，生長被抑制，血流灌注量先升后降，納米藥物注射第6 天后與磷酸緩沖液組基本一致。

3 結(jié)論

監(jiān)測腫瘤微環(huán)境對研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理機制及預后具有至關重要的意義。本文通過將DSFC模型應用在乳腺癌腫瘤活體成像，將體視顯微與激光散斑成像應用于腫瘤微環(huán)境的監(jiān)測，旨在為抗腫瘤藥物治療研究提供一種直觀、可視化的動態(tài)觀測方法。本研究工作選擇生長速度較快的鼠源4T1 乳腺癌細胞來構建小鼠腫瘤DSFC 模型，在裸鼠DSFC視窗內(nèi)接種4T1 細胞3～5 d 后，90%以上的DSFC 小鼠可成功成瘤。利用此平臺，對實驗室前期合成的抗腫瘤納米基因治療藥物PCL-PDEM-siRNA 治療小鼠乳腺癌的過程進行活體可視化連續(xù)觀察，可以監(jiān)測視窗達22 d 以上。實驗結(jié)果表明，視窗內(nèi)腫瘤組的血流灌注量越來越大，腫瘤的體積和面積也增大，腫瘤內(nèi)部新生血管增多，腫瘤周圍毛細血管延長、連接、變粗；而納米藥物治療組腫瘤的體積和面積在藥物注射4 d 后不再增大，腫瘤內(nèi)部新生血管數(shù)量較腫瘤組少，血流灌注量在藥物治療6 d 后趨于平穩(wěn)，該研究從可視化定性和定量的角度揭示了基因治療藥物PCL-PDEM-siRNA 對小鼠乳腺癌及其微環(huán)境的作用效果。為腫瘤微環(huán)境可視化及定量化提供新的策略，對腫瘤生物學的基礎研究和抗腫瘤藥物研發(fā)具有重要意義。