莫鉆蘭 李 敏 黃炳熾 彭家杰 洪偉彬 胡健聲 黃潔瑩

廣東省東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東東莞523000

急性肝胰腺壞死?。╝cute hepatopancreatic ne?crosis disease，AHPND），因其主要發(fā)生于蝦苗放養(yǎng)后7～30 d，又名早期死亡綜合征（early mortality syn?drome，EMS）[1-2]，死亡率可達(dá)100%[3]，是近年來出現(xiàn)的一種新型致命性的細(xì)菌性疾病，主要危害凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）、斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）和中國明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）。該病最早于2010年被發(fā)現(xiàn)，近年來，馬來西亞、越南、泰國、菲律賓、墨西哥等國家相繼有所報(bào)道[4-9]，使全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)每年損失近10 億美元[10]，嚴(yán)重影響了對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

血清學(xué)分型、生化鑒定是檢測(cè)鑒定細(xì)菌的經(jīng)典方法，郭書林等[11]研究發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOF-MS 檢測(cè)效率高于生化鑒定方法，與PCR 結(jié)合使用更有利于急性肝胰腺壞死病的診斷和監(jiān)測(cè)。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多商品化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒被研發(fā)出來。本研究就本實(shí)驗(yàn)室參加的急性肝胰腺壞死能力測(cè)試的樣品來對(duì)比和分析不同商品化熒光定量PCR 試劑盒檢測(cè)結(jié)果的一致性。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）樣品。此次待檢樣品和陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均由中國水產(chǎn)研究院黃海水產(chǎn)研究所（以下簡(jiǎn)稱黃海所）提供。8 份樣品均保存于95%乙醇中，編號(hào)為107873、107231、107122、107512、107243、107235、107431、107233。

2）試劑。海洋動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒（批號(hào)：S8107）購自天根；引物探針（批號(hào)：111516527）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；預(yù)混液（批號(hào)：AK11116A）購自Takara；3 種商品化的對(duì)蝦肝胰腺壞死熒光PCR 檢測(cè)試劑盒分別來自不同生產(chǎn)廠家：A（批號(hào)：200417）、B（批號(hào)：67054）、C（批號(hào)：JC0003202006）。

3）儀器設(shè)備。生物安全柜，高速離心機(jī)，熒光PCR儀。

1.2 方 法

1）本次能力測(cè)試要求的檢測(cè)方法。按照黃海所下發(fā)的《病原測(cè)試項(xiàng)目作業(yè)指導(dǎo)書》，依據(jù)SC/T 7233-202X《急性肝胰腺壞死病診斷規(guī)程》（報(bào)批稿）進(jìn)行試驗(yàn)分析。

①核酸提取。使用天根DNA 提取試劑盒，依其說明書提取急性肝胰腺壞死病毒的核酸。

②qPCR 檢測(cè)。按表1 中引物和探針配置qP?CR 反應(yīng)體系，分裝到PCR 管中，分別加入樣品模板DNA，陰性對(duì)照和陽性對(duì)照?；靹螂x心后，置于熒光定量PCR 儀中。按表1 中的反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，25 μL PCR 反 應(yīng) 體 系，包 括：2×PCR Premix（Probe qPCR）12.5 μL、引物VpPirA-F（10 mol/L）0.75 μL、引物VpPirA-R（10 mol/L）0.75 μL、Taq?man Probe（10 mol/L）0.25 μL、模板DNA（濃度：50～100 ng/μL）1 L、滅菌雙蒸水9.75 μL。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)詳見表2。

表1 qPCR檢測(cè)的引物、探針、反應(yīng)程序和時(shí)間

表2 試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

2）商品化的急性肝胰腺壞死實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。以本次參測(cè)盲樣為樣品，從市場(chǎng)上選取3家不同廠家生產(chǎn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)（由A、B、C 代替）進(jìn)行試驗(yàn)與分析，3 種試劑盒的試驗(yàn)成立標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)各不相同（表3）。按照各自試劑盒說明書配制熒光PCR 反應(yīng)體系，依次加入陰性對(duì)照、樣品核酸和陽性對(duì)照，加樣后及時(shí)蓋緊管蓋，做好標(biāo)記，混勻后離心，按照各自的反應(yīng)程序擴(kuò)增。

表3 不同試劑盒的反應(yīng)體系、反應(yīng)時(shí)間、試驗(yàn)成立和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸檢測(cè)結(jié)果

依據(jù)《SC/T 7233-202X》（報(bào)批稿）方法對(duì)樣品進(jìn)行試驗(yàn)分析。如圖1所示，陽性質(zhì)控Ct值為22.65且有典型的S 型曲線，陰性對(duì)照無Ct 值，試驗(yàn)成立。樣 品107243、107431、107235、107231、107873 在FAM 通道有典型的擴(kuò)增曲線且Ct 值分別為15.09，28.14，32.64，33.15 和33.5，樣 品107122、107233、107512 均無Ct 值。因此，可判樣品107243、107431、107235、107231、107873 為Vahpnd 核酸陽性，樣品107122、107233、107512 為Vahpnd 核酸陰性，檢測(cè)結(jié)果為滿意。

圖1 Vahpnd的擴(kuò)增曲線圖

2.2 商品化的急性肝胰腺壞死實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

各試驗(yàn)陰、陽對(duì)照符合說明書的試劑成立標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)均成立。但是，只有A、C 與對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果一致，B均未檢出陽性盲樣（圖2）。如表3所示，C試劑的反應(yīng)時(shí)間較A 略快，分別是56 min 和66 min。設(shè)定相同閾值時(shí)，A 試劑檢測(cè)的5 個(gè)陽性樣品的Ct值要略小于C試劑（表4）。

圖2 不同試劑的擴(kuò)增曲線圖

表4 設(shè)定相同閾值時(shí)，A、C試劑檢測(cè)出的陽性樣品的Ct值

3 討 論

本次能力驗(yàn)證的檢測(cè)依據(jù)《SC/T 7233-202X《急性肝胰腺壞死病診斷規(guī)程》（報(bào)批稿）》中可以采用商品化探針法qPCR，但也同時(shí)強(qiáng)調(diào)的是需要有同等效果。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)上3 種商品化熒光定量qPCR 試劑盒，A和C的檢測(cè)結(jié)果符合能力驗(yàn)證的結(jié)果，因此，實(shí)驗(yàn)室在選用商品化試劑盒時(shí)需要做試劑比對(duì)，更有利于確保檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

本次試驗(yàn)設(shè)置相同的閾值為20，A 試劑的Ct 值偏小。研究發(fā)現(xiàn)：Ct 值與該DNA 模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈反比[12]，但是，A 試劑加入的模板量大于C 試劑，因此，不能判斷A 試劑的靈敏度高于C 試劑。對(duì)比A、C試劑擴(kuò)增曲線圖，發(fā)現(xiàn)A 試劑在40個(gè)循環(huán)后還出現(xiàn)了緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，C 試劑更接近S形，可推測(cè)為A 試劑的反應(yīng)液還有較充足的離子、酶、能量等。這是因?yàn)殡S著PCR 循環(huán)的增多，產(chǎn)物增長(zhǎng)的速度逐漸減緩，待所有的dNTP、酶等被基本用盡后，擴(kuò)增曲線就進(jìn)入了平臺(tái)期[13]。結(jié)合表1 和表3，標(biāo)準(zhǔn)方法的反應(yīng)時(shí)間是60 min，A 試劑的反應(yīng)時(shí)間為66 min，C 試劑的反應(yīng)時(shí)間為56 min。在實(shí)際工作中，如果想盡快得到檢測(cè)結(jié)果，可選C試劑。