周家旺，陸國海，李曉林*

(1.南通大學(xué)附屬吳江醫(yī)院，蘇州市第九人民醫(yī)院 骨科，江蘇 蘇州 215200；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，蘇州市立醫(yī)院(北區(qū))骨科，江蘇 蘇州 215008)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)是近年來新發(fā)現(xiàn)的、BMPs家族中骨誘導(dǎo)能力最強的蛋白，是目前骨組織工程中研究的熱點，有關(guān)BMP9成骨誘導(dǎo)的機(jī)制仍不完善[1-2]。Orai1最初是從免疫細(xì)胞中鑒定而來，越來越多的研究表明Orai1在其他類型細(xì)胞中也起著重要作用的觀點[3-4]。新近的研究發(fā)現(xiàn)Orai1在骨骼代謝中具有重要作用。Orai1基因敲除小鼠出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松現(xiàn)象，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Orai1功能的抑制可導(dǎo)致破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化受損[5-6]。而有關(guān)Orai1在成體干細(xì)胞中的功能研究仍無研究報道。本研究擬通過體內(nèi)外實驗研究Orai1的功能，并探索Orai1在BMP9誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)骨向分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級雄性BALB/c裸鼠30只，體質(zhì)量15～25 g，6周齡(南京青龍山實驗動物繁殖場，動物合格證號：蘇20180079)。其中6只BALB/c裸鼠用于BMSCs細(xì)胞提取，24只用于體內(nèi)實驗。

1.1.2 實驗試劑：BMP9(Santa Cruz公司)；堿性磷酸酶ELISA試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；RNA提取試劑盒，Trizol(Life Technologies公司)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin2000TM(Invitrogen公司)；堿性磷酸酶染色試劑盒、茜素紅染色試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；Orai1單克隆抗體(Abcm公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的獲取和培養(yǎng)：0.5%戊巴比妥麻醉后利用斷頸法處死裸鼠后，取長短骨骨髓組織置于三抗DMEM培養(yǎng)基中，通過200目濾網(wǎng)篩去摻雜物，將懸浮細(xì)胞以1 000 r/min離心5 min，PBS吹打后移入含新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，并放入37 ℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞匯合80%時胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 BMP9誘導(dǎo)BMSCs成骨分化：取1.0×105個/孔的第3代BMSCs接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，更換含10-5mol/L BMP9的含10% FBS培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.3 轉(zhuǎn)染與實驗的分組：取1.0×105個/孔第3代BMSCs接種于24孔板中，利用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合40%時滴入Ad-si-Orai1或Ad-RFP(si-NC)，感染24 h后加入10-5mol/L BMP9。根據(jù)條件將實驗分為4組：對照組、10-5mol/L BMP9組、空白+si-Orai1組和10-5mol/L BMP9+si-Orai1組。

1.2.4 骨誘導(dǎo)染色：骨向誘導(dǎo)21 d后，倒去細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，10%甲醛 10 min后蒸餾水清洗3次，室溫下加入0.1%茜素紅-Hris-Hcl染液，放置30 min后蒸餾水清洗。同理，在骨向誘導(dǎo)7 d時利用10%甲醛 10 min后蒸餾水清洗3次，室溫下滴加底物作用液10 min后蒸餾水清洗后加入2%堿性磷酸酶染色，水洗封固，倒置相差顯微鏡觀察。

1.2.5 RT-qPCR檢測Orai1、OPN、OCNmRNA表達(dá)：骨向誘導(dǎo)21 d后，按細(xì)胞裂解后Trizol試劑盒說明書分離總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，然后上機(jī)進(jìn)行實時定量PCR，GAPDH作為內(nèi)參，所用引物序列：Orai1上游，5′-TTTGCCCTCATGATCAGCAC-3′，下游，5′-TTGGCGACGATGACTGATTC-3′；RUNX2上游，5′-CCGAAATGCCTCCGCTGTTATG-3′，下游，5′-TCTGTCTGTGCCTTCTTGGTTCC-3′；OPN上游，5′-GCAGAGAGCGAGGATTCTGT-3′，下游，5′-TGTA GGGACGATTGGAGTGA-3′；OCN上游，5′-AGCAGC TTGGCCCAGACCTA-3′，下游，5′-TAGCGCCGGAGT CTGTTCACTAC-3′；GAPDH上游，5′-GGCTGCCCAG AACATCAT-3′，下游，5′-CGGACACATTGGGGGTA G-3′。

1.2.6 Western blot檢測Orai1蛋白表達(dá)：骨向誘導(dǎo)21 d后，細(xì)胞裂解后BCA法提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后加入單克隆抗體Orai1(1∶1 000)孵育3 h，TBST清洗后孵育二抗過夜，滴加顯色劑后進(jìn)行曝光。

1.2.7 體內(nèi)實驗：將羥基磷灰石/聚乳酸/殼聚糖材料制備成5 mm×3 mm×3 mm圓柱狀，1.0×105個BMSCs通過微型移液槍植入支架，在DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)48 h。24只BALB/c裸鼠分3組：BMSCs+支架組；Ad-BMP9+支架組；Ad-BMP9/si-Orai1+支架組，復(fù)合材料植入裸鼠背部皮下組織，4周后取出復(fù)合材料進(jìn)行HE染色和Masson染色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BMP9對Orai1表達(dá)的影響

隨著時間增加，Orai1mRNA表達(dá)逐漸升高，從第5天開始顯著高于對照組(P<0.05)(圖1)?；蚯脺p后Orai1基因和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖2A,B)。

*P<0.05,**P<0.01 compared with vehicle group圖1 不同時間點Orai1基因表達(dá)Fig 1 Gene expression of Orai1 at different time n=3)

A.comparison of Orai1 gene expression levels between vehicle group and BMP9 group before and after Orai1 gene knockdown;B.comparison of Orai1 protein expression levels between vehicle group and BMP9 group before and after Orai1 gene knockdown;*P<0.01 compared with vehicle group

2.2 Orai1對BMSCs骨向分化的影響

BMP9顯著提高鈣鹽沉積和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)生成，Orai1敲減后顯著降低這一現(xiàn)象(P<0.05)(圖3A,C)；同時，骨向誘導(dǎo)21 d時鈣鹽沉積和7 d時ALP化學(xué)定量檢測結(jié)果提示Orai1敲減后BMP9骨向誘導(dǎo)效果顯著降低(P<0.05)(圖3B,D)；Orai1敲減后能顯著降低BMP9誘導(dǎo)的骨性標(biāo)志物RUNX2、OPN和OCN mRNA的表達(dá)(P<0.05)(圖3E～G)。

A.BMP9 significantly increased calcium deposition and ALP production;B.the results of calcium salt deposition on the 21st day of osteotropism induction and ALP chemical quantitative detection on the 7th day beforer Orai1 knockdown;C.Calcium deposition and ALP production decreased significantly after Orai1 knockdown;D.the results of calcium salt deposition on the 21st day of osteotropism induction and ALP chemical quantitative detection on the 7th day after Orai1 knockdown;E.the mRNA expression of bone marker Runx2 induced by BMP9 decreased significantly after Orai1 knockdown;F.the mRNA expression of bone marker OPN induced by BMP9 decreased significantly after Orai1 knockdown;G.the mRNA expression of bone marker OCN induced by BMP9 decreased significantly after Orai1 knockdown;*P<0.05,**P<0.01 compared with vehicle group

2.3 Orai1在體內(nèi)對BMSCs骨向分化的影響

4周后單純細(xì)胞組鮮有成塊骨組織長出，而BMP9組可見明顯的板狀骨塊生存，并可見大量骨基質(zhì)，Orai1敲減后仍可見少量骨基質(zhì)及板狀骨形成，較BMP9組顯著減少；同時BMP9組可見大量紅染的骨基質(zhì)及骨塊形成，而Orai1敲減后骨基質(zhì)和板狀骨量明顯減少(圖4)。

NB.new bone;BM.bone matrix;S.scaffold material圖4 各組裸鼠異位成骨的組織學(xué)觀察Fig 4 Histological observation of heterotopic osteogenesis in nude mice(×400)

3 討論

BMP9是新近發(fā)現(xiàn)的BMPs家族成員之一，目前為止，BMPs 2/4/6/7/9已被證明具有成骨潛能，其中BMP9具有最強的成骨潛能[7]。新的證據(jù)表明，BMP9除了具有成骨活性外，還具有廣泛的生物學(xué)功能，包括干細(xì)胞分化、血管生成、神經(jīng)病變、腫瘤發(fā)生和代謝[8-9]。BMP9的功能和機(jī)制需深入研究。因此，BMP9具有非常大的應(yīng)用潛能。

Ca2+在骨向分化過程中起重要作用。Orai1是一種具有高度選擇性的鈣離子通道蛋白，Orai1促進(jìn)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流主要通過鈣庫依賴的鈣釋放激活鈣通道或非鈣庫依賴的花生四烯酸調(diào)節(jié)的鈣通道白三烯C4調(diào)節(jié)的鈣通道[10]。研究顯示，成骨細(xì)胞介導(dǎo)鈣和磷酸鹽沉積于Ⅰ型膠原基質(zhì)，從而形成高礦化骨基質(zhì)。細(xì)胞外高濃度Ca2+在體外可促進(jìn)BMSCs成骨分化[11]。已知維生素D，鈣穩(wěn)態(tài)和骨礦化的主要調(diào)節(jié)因子，在體外能現(xiàn)在刺激BMSCs成骨分化[12-13]。維生素D和雌激素通過引起細(xì)胞外鈣離子快速內(nèi)流發(fā)揮作用[14-15]。因此，Orai1可能通過允許胞外Ca2+內(nèi)流參與信號傳導(dǎo)以促進(jìn)骨向誘導(dǎo)，并在誘導(dǎo)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

Orai1是否在BMP9誘導(dǎo)的MSCs骨向分化過程中產(chǎn)生作用仍不清楚。本研究中，研究者首先在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10-5mol/L BMP9，構(gòu)建骨向誘導(dǎo)條件，觀察不同時間段Orai1基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著時間增加，Orai1 mRNA表達(dá)逐漸升高，從第5天開始顯著高于對照組，提示Orai1參與BMP9誘導(dǎo)的BMSCs骨向分化過程。為進(jìn)一步驗證Orai1功能，通過基因敲減技術(shù)發(fā)現(xiàn)Orai1敲減后能顯著抑制BMP9誘導(dǎo)的BMSCs骨向分化，提示Orai1能介導(dǎo)BMP9誘導(dǎo)的骨向分化功能。為了驗證Orai1在體內(nèi)是否有相似功能，通過將細(xì)胞復(fù)合組織工程支架，本研究發(fā)現(xiàn)Orai1敲減后能顯著抑制BMP9誘導(dǎo)的骨向分化能力，從組織學(xué)層面驗證了Orai1介導(dǎo)BMP9誘導(dǎo)的骨向分化過程。

綜上，本研究通過體內(nèi)外實驗探索了Orai1在BMP9誘導(dǎo)的BMSCs骨向分化過程中的功能，為BMP9的機(jī)制研究提供新的依據(jù)。