程 濤，馬程遠，尹亞楠，孫貝貝

(1.南陽市第一人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 南陽473000；2.河南省人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)簡稱慢阻肺，其發(fā)生受到外界環(huán)境因素及遺傳因素等多方面的影響，吸煙是COPD最常見的危險因素，可導(dǎo)致肺部發(fā)生慢性炎性反應(yīng)，損傷肺組織修復(fù)功能，大量釋放的炎性因子又可進一步加重氣道重塑，誘發(fā)肺大皰、肺氣腫和間質(zhì)性改變等典型COPD癥狀[1-2]。依達拉奉(edaravone，EDA)是一種腦保護劑，通過清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化減輕腦細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，腦梗死急性期給予患者EDA可增加梗死區(qū)周圍局部腦血流量，有利于改善急性腦梗死所致的神經(jīng)癥狀和功能障礙[3]。研究表明，EDA可通過抗氧化和抗炎作用對多種原因誘發(fā)的肺損傷產(chǎn)生保護作用，對COPD亦具有良好的治療作用，但其作用機制尚不清楚[4-5]。本研究通過氣管滴注脂多糖(lipopolysachrides，LPS)聯(lián)合煙熏法制備大鼠COPD模型，觀察EDA對COPD治療的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：50只SD大鼠(SPF級，雌雄各半，6周齡，體質(zhì)量180～220 g)，購買自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2017-0011。研究方案獲本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 藥品與試劑：EDA(國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司)；大前門香煙(上海煙草集團有限責(zé)任公司)；LPS、HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；ELISA試劑盒(Elabscience Biotechnology Co.,Ltd)；半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)p65、NF-κB抑制蛋白α(inhibitor α of NF-κB，IκBα)、磷酸化IκBα(pho-sphonated IκBα，p-IκBα)、Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)、β-肌動蛋白(β-actin)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)、髓樣分化因子(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)兔源單克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、建模及給藥處理：50只大鼠被隨機均分為對照組、模型組、EDA高劑量組、中劑量組、低劑量組。在模型組、EDA高劑量組、中劑量組、低劑量組的大鼠中建立COPD模型，造模方法見參考文獻[6],在第1天和第14天時麻醉大鼠，氣管滴注200 μL 1 mg/L LPS溶液，第2～13天和第15～28天時，每天20∶00將大鼠放置在密閉玻璃箱中定時煙熏30 min。對照組大鼠僅在其余大鼠滴注LPS時同時滴注等量0.9%氯化鈉溶液，煙熏造模期間放置在密閉玻璃箱中但不進行煙熏處理。每次煙熏前，EDA高、中和低劑量組大鼠腹腔注射40、20、10 mg/kg的EDA，對照組和模型組動物不作給藥處理，僅腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 檢測肺功能：末次給藥結(jié)束后2 h，用小動物肺功能檢測儀檢測大鼠肺功能指標(biāo)，包括：靜息呼吸頻率[frequency of breathing,f(B)]、氣道阻力(airway resistance，RI)、吸氣峰流速(peak inhale flow，PIF)、動態(tài)肺順應(yīng)性(dynamic lung compliance，Cdyn)。

1.2.3 檢測肺濕干重比(W/D)：處死大鼠，分離右上肺葉，記錄濕重(W)，然后放置于恒溫干燥箱(80 ℃)烘烤48 h，記錄干重(D)，濕重與干重之比即為W/D。

1.2.4 ELISA檢測肺組織SOD、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量：按照試劑盒說明書指定方法測定各因子的含量。

1.2.5 肺組織HE染色：將肺組織置于4%多聚甲醛中固定處理48 h，制作組織切片，脫蠟、復(fù)水后行HE染色。

1.2.6 Western blot：提取肺組織蛋白樣品并測定其濃度，蛋白變性后按照30 μg/孔的上樣量進行SDS-PAGE電泳，分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，再將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中，放入恒溫?fù)u床，室溫下封閉2 h，清洗，分別加入對應(yīng)的一抗稀釋液(1∶1 000)中，放入4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜，再放入二抗稀釋液(1∶1 000)中，置于37 ℃搖床中繼續(xù)孵育2 h，清洗后滴加適量的發(fā)光試劑，放入凝膠成像儀中顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肺功能檢測結(jié)果比較

模型組靜息呼吸頻率和RI高于對照組，而PIF和Cdyn值低于對照組(P<0.05)；與模型組比較，EDA高、中和低劑量組靜息呼吸頻率和RI回降，而Cdyn和PIF值回升(P<0.05)(圖1)。

A.frequency of breathing;B.RI;C.PIF;D.Cdyn;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with model group圖1 肺功能檢測結(jié)果比較Fig 1 Comparison of lung function test results n=10)

2.2 肺組織氧化應(yīng)激水平和W/D比較

模型組肺組織SOD活力低于對照組，而MDA含量和肺W/D高于對照組(P<0.05)；與模型組比較，EDA高、中和低劑量組SOD活力回升，而MDA含量和肺W/D回降(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with model group圖2 肺組織氧化應(yīng)激因子的含量和W/D值比較Fig 2 Comparison of the levels of oxidative stress factors and W/D in lung tissues n=10)

2.3 肺組織炎性因子水平比較

模型組肺組織炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量高于對照組，EDA高、中和低劑量組炎性因子的含量低于模型組(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with model group圖3 肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較Fig 3 Comparison of TNF-α,IL-1β and IL-6 contents in lung tissues n=10)

2.4 肺組織HE染色

與對照組比較，模型組大鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤明顯，肺泡壁增厚，肺間質(zhì)水腫、充血。與模型組比較，EDA各劑量組大鼠肺組織炎性浸潤和肺組織結(jié)構(gòu)改變得到改善，高劑量EDA效果最佳(圖4)。

A.control group;B.model group;C.EDA high dose group;D.EDA medium dose group;E.EDA low dose group

2.5 Western blot檢測肺組織caspase-3、MMP-9和TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達

與對照組比較，模型組caspase-3、MMP-9、TLR4、MyD88表達增加，IκBα磷酸化水平顯著升高，NF-κB p65 核內(nèi)轉(zhuǎn)移明顯(P<0.05)；與模型組比較，EDA高、中和低劑量組caspase-3、MMP-9、TLR4、MyD88表達降低，IκBα磷酸化及NF-κB p65核轉(zhuǎn)位水平降低(P<0.05)(圖5，表1)。

A.control group;B.model group;C.EDA high dose group;D.EDA medium dose group;E.EDA low dose group圖5 Western blot檢測肺組織蛋白表達Fig 5 Protein expression in lung tissues was detected by Western blot

表1 各組大鼠肺組織蛋白表達水平比較Table 1 Comparison of lung tissue protein expression levels of rats in each group n=10)

3 討論

EDA是一種自由基清除劑，臨床常用于改善急性腦梗死所致的神經(jīng)癥狀、日?；顒邮芟藓凸δ苷系K。研究證明，EDA對COPD患者具有一定治療作用，但其作用和機制尚不清楚[7]。本研究采用氣管滴注LPS聯(lián)合煙熏法制備大鼠COPD模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠肺功能降低，肺組織氧化應(yīng)激損傷和炎性反應(yīng)明顯，表明慢阻肺大鼠模型建立成功。COPD患者常表現(xiàn)為明顯的氣流受限和阻塞性通氣障礙[8]。在本研究中，EDA呈劑量依賴性提高大鼠肺功能，改善氣流受限和通氣障礙癥狀,減輕肺組織炎性浸潤和結(jié)構(gòu)改變，表明EDA可顯著改善COPD肺組織功能結(jié)構(gòu)損傷。

研究表明，香煙煙霧與COPD的發(fā)展密切相關(guān)，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激，使肺組織損傷進一步惡化[9]。本研究顯示，EDA呈劑量依賴性增加COPD大鼠肺組織SOD活力，降低MDA含量及炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，表明不同劑量的EDA均可減輕COPD大鼠肺組織氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)家族是肺組織細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)機制的重要組成部分，caspase-3則是機體各種凋亡調(diào)節(jié)過程的中心環(huán)節(jié)，研究表明，COPD患者肺泡灌洗液中caspase-3的表達顯著升高[10]。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分的基質(zhì)降解酶，其中MMP-9在細(xì)胞遷移和氣道炎性反應(yīng)中起主要作用，在多種肺疾病中高表達[11]。在本研究中，EDA呈劑量依賴性降低肺組織caspase-3、MMP-9的表達。先天免疫的激活是炎性反應(yīng)的第一防線，由模式識別受體，尤其是Toll 樣受體(toll-like receptor，TLR)識別并啟動，TLR4是該家族的重要成員，MyD88是TLRs家族下游炎性通路的經(jīng)典分子，通過TLR家族成員與 IL-1R 相關(guān)激酶家族相互作用激活NF-κB信號通路，導(dǎo)致NF-κB抑制蛋白IκBα磷酸化，使NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位，誘發(fā)并加重炎性反應(yīng)，促進細(xì)胞凋亡，抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活可減輕炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，EDA呈劑量依賴性降低TLR4、MyD88、NF-κB p65表達，表明EDA可抑制TLR4/NF-κB信號通路的活化。

綜上所述，EDA可改善COPD大鼠肺功能，減輕肺組織損傷及炎性和氧化應(yīng)激水平。