劉秀潔，王新雨，宋正陽(yáng)，樓國(guó)強(qiáng)，郝卯林，錢(qián) 巍，王萬(wàn)鐵*

(1.溫州醫(yī)科大學(xué) 缺血/再灌注損傷研究所，浙江 溫州 325035；2.杭州臨安區(qū)人民醫(yī)院 全科醫(yī)療科，浙江 杭州 311300)

肺缺血/再灌注損傷(lung ischemia-reperfusion injury，LI/RI)是一種急性肺損傷，發(fā)生于肺缺血一段時(shí)間后再灌注，其發(fā)生率隨著肺溶栓、肺移植等技術(shù)的開(kāi)展正逐漸增加[1-2]。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cell type Ⅱ，AEC Ⅱ)是急性肺損傷中的重要效應(yīng)細(xì)胞，其低氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygeneration，H/R)可以很好地模擬肺的缺血/再灌注過(guò)程[3-4]。近年來(lái)，細(xì)胞自噬(autophagy)在缺血/再灌注損傷中的作用是較為熱門(mén)的研究?jī)?nèi)容，在腦、心、肝、腎等重要臟器的缺血/再灌注損傷中，細(xì)胞自噬均發(fā)揮重要作用[5-8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建大鼠AEC Ⅱ的低氧/復(fù)氧模型，旨在探討細(xì)胞自噬在LI/RI中的作用，為相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系(上海拜力生物科技有限公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibico公司)；二甲基亞砜(DMSO)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)和雷帕霉素(上海生工生物技術(shù)有限公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué))，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher scientific公司)；引物設(shè)計(jì)合成(上海捷瑞生物工程有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所)；自噬相關(guān)蛋白p-AMPK/AMP、p-mTOR/mTOR、LC3Ⅱ、p62、Beclin-1、GAPDH抗體(Abcam公司)；二抗(中國(guó)博蘊(yùn)生物科技有限公司)；其余均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 大鼠AEC Ⅱ低氧/復(fù)氧模型制備：選擇處于對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞，首先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓處理，即使用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基。24 h后更換為無(wú)糖無(wú)血清的培養(yǎng)基作為低氧緩沖液，置于低氧培養(yǎng)箱中(參數(shù)為37 ℃，94% N2，1% O2，5% CO2)培養(yǎng)6 h，模擬低氧過(guò)程。再更換成無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，常氧培養(yǎng)箱中(參數(shù)為37 ℃，21% O2，5% CO2)培養(yǎng)24 h，模擬復(fù)氧過(guò)程。

1.2.2 細(xì)胞的分組與處理：按照隨機(jī)原則將大鼠AEC Ⅱ分為5組，饑餓處理24 h。將細(xì)胞分為：1)對(duì)照組(C)：使用DMEM高糖培養(yǎng)液，AEC Ⅱ于常氧培養(yǎng)箱中培育30 h；2)低氧/復(fù)氧組(H/R)：使用無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)液，低氧培養(yǎng)6 h，再用無(wú)血清高糖DMEM常氧環(huán)境復(fù)氧培養(yǎng)24 h；3)DMSO溶劑組(HD)：低氧前1 h在無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)液中加入0.1%二甲基亞砜(DMSO)預(yù)處理，余處理同H/R組；4)自噬激動(dòng)劑組(RAP)：低氧前1 h用培養(yǎng)基濃度為250 nmol/L的雷帕霉素(Rapamycin)預(yù)處理，余處理同H/R組；5)自噬抑制劑組(3-MA)：低氧前1 h用培養(yǎng)基濃度為5 mmol/L 的3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)預(yù)處理，余處理同H/R組。

1.2.3 CCK8法檢測(cè)AECⅡ細(xì)胞活力：按照CCK-8法試劑盒說(shuō)明書(shū)，造模完成后對(duì)細(xì)胞活力測(cè)定：用PBS緩沖液清洗3次。每孔加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)基和10 μL/CCK8溶液，避光操作，同時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。常氧培養(yǎng)箱中孵育1 h，待孔中樣本變成棕黃色時(shí)，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的A值。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因mRNA：用Trizol對(duì)RNA進(jìn)行抽提，并通過(guò)測(cè)定樣品吸光度比值測(cè)定濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，由上海生工進(jìn)行引物序列的設(shè)計(jì)和合成序列 (表1)。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：94 ℃起始變性3 min；[94 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min]30個(gè)循環(huán)，72 ℃終止延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，灰度成像用ImageJ軟件分析電泳圖，用內(nèi)參GAPDH的吸光度值計(jì)算LC3、Beclin-1、mTOR、AMPK和p62 mRNA的相對(duì)含量。

表1 引物序列及擴(kuò)增片段大小Table 1 Primer pair sequence and amplified product size

1.2.5 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白：造模結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，加入裂解混合液(PMSF∶RAPI=1∶100)冰上裂解30 min，用細(xì)胞刮適當(dāng)研磨，裂解完成后離心(20 min，4 ℃，12 000 r/min)，取上清液，得到的蛋白溶液進(jìn)行BCA蛋白定量。之后用Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)，主要包括SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))、封閉與雜交、化學(xué)發(fā)光并成像，用ImageJ軟件進(jìn)行吸光度值分析，其中LC3 Ⅱ、Beclin-1、p62蛋白條帶各自分別與內(nèi)參蛋白GAPDH條帶的累積吸光度(A)相比，比值反映了蛋白表達(dá)水平，將p-AMPK與AMPK、p-mTOR與mTOR的蛋白條帶A之比作為反映蛋白磷酸化表達(dá)水平的相對(duì)指標(biāo)。

1.2.6 透射電鏡觀察AECⅡ超微結(jié)構(gòu)及自噬情況：造模結(jié)束后，細(xì)胞經(jīng)2.5%戊二醛前固定，再用1%鋨酸后固定，之后依次經(jīng)1%醋酸鈾塊染，梯度脫水、浸透、包埋、切半薄、染色、切超薄，電鏡下觀察各標(biāo)本細(xì)胞超微觀結(jié)構(gòu)改變情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活力情況

與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞測(cè)得的CCK-8細(xì)胞活力值明顯下降(P<0.01)；與H/R組相比，3-MA組的細(xì)胞活力回升(P<0.01)(圖1)。

*P<0.01 compare with control group;#P<0.01 compare with H/R group圖1 各組細(xì)胞活性A值表達(dá)變化Fig 1 The bar graph of absorbance in each group

2.2 各組AEC Ⅱ自噬相關(guān)蛋白基因(mRNA)的表達(dá)變化

與對(duì)照組相比，H/R細(xì)胞的正性自噬蛋白相關(guān)基因AMPK、Beclin-1和LC3 mRNA表達(dá)均上調(diào)，同時(shí)負(fù)性自噬蛋白相關(guān)基因mTOR和p62 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)；與H/R組相比，3-MA組的AMPK、Beclin-1和LC3 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，而mTOR和p62 mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)(圖2)。

*P<0.01 compare with control group;▲P<0.01 compared with H/R group圖2 各組細(xì)胞AMPK、Beclin-1、LC3、mTOR、p62 mRNA表達(dá)變化比較Fig 2 mRNA expression levels of AMPK,Beclin-1,LC3,mTOR,p62 in each group

2.3 各組AEC Ⅱ自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化

與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞的AMPK蛋白磷酸化水平和Beclin-1、LC3 Ⅱ 蛋白表達(dá)均有明顯升高，而mTOR蛋白磷酸化水平和p62蛋白表達(dá)均有下降(P<0.05)；與H/R組相比，應(yīng)用自噬抑制劑3-MA后，該組細(xì)胞p-AMPK、Beclin-1和LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)下降，p-mTOR和p62蛋白表達(dá)則上升(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compare with control group;▲P<0.05 compare with H/R group圖3 各組細(xì)胞p-AMPK、Beclin-1、LC3Ⅱ、p-mTOR、p62 蛋白表達(dá)變化比較Fig 3 Protein expression levels of p-AMPK,Beclin-1,LC3Ⅱ,p-mTOR,p62 in each group

2.4 各組肺組織超微結(jié)構(gòu)的變化

透射電鏡下可見(jiàn)，對(duì)照組AECⅡ的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，線粒體豐富且嵴線分明，板層小體充滿(mǎn)內(nèi)容物；其余各組的細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的紊亂。其中H/R、DMSO、Rap組的線粒體發(fā)生高度腫脹，水腫，嵴線溶解甚至消失，板層小體內(nèi)容物減少，可見(jiàn)自噬小體的形成；而3-MA組的細(xì)胞損傷則減輕，線粒體輕微腫脹，結(jié)構(gòu)相對(duì)較為完整，板層小體存留有較多內(nèi)容物，無(wú)明顯細(xì)胞自噬小體(圖4)。

Yellow arrows:mitochondria;blue arrows:lamellar corpuscle;red arrows:cytophagosome圖4 各組細(xì)胞電鏡超微結(jié)構(gòu)圖Fig 4 Cell ultrastructure of each group under electron microscope(×20 000)

3 討論

細(xì)胞自噬一般發(fā)生在組織細(xì)胞缺乏營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、微生物感染以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)衰老細(xì)胞器進(jìn)行更新之時(shí)，通過(guò)在緊急狀態(tài)下?tīng)奚徊糠旨?xì)胞器來(lái)?yè)Q取細(xì)胞的存活。但在某些肺部疾病中，細(xì)胞自噬往往會(huì)出現(xiàn)過(guò)度激活而引起細(xì)胞死亡[9]。自噬誘導(dǎo)因素包括氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等，而在肺的缺血/再灌注損傷中，組織細(xì)胞的低氧/復(fù)氧可能引起細(xì)胞自噬。自噬的調(diào)節(jié)非常復(fù)雜，常見(jiàn)的細(xì)胞自噬信號(hào)通路有AMPK-mTOR-ULK1/2通路、PI3KI-Akt-mTOR通路、MAPK-Erk1/2-mTOR通路、p53通路、氨基酸代謝通路等[10-12]。

細(xì)胞自噬過(guò)程中，AMP依賴(lài)的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)代謝的感受因子，細(xì)胞血清饑餓時(shí)會(huì)大大上升。而哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能感受包括來(lái)自氨基酸、生長(zhǎng)因子、氧氣及能量代謝水平等信號(hào)，協(xié)調(diào)細(xì)胞的代謝和增殖的作用，而活化的mTORC1通過(guò)磷酸化自噬起始復(fù)合物而抑制自噬。而雷帕霉素(Rapamycin)作為mTOR的特異性抑制劑，可以起到激動(dòng)自噬的效果[13]。正常情況下，Bcl-2會(huì)與Beclin-1形成復(fù)合物抑制自噬，當(dāng)存在自噬誘導(dǎo)因素時(shí)，Beclin-1會(huì)被釋放并與PI3K class Ⅲ、VPS15同時(shí)形成PI3K class Ⅲ-VPS15-Beclin1復(fù)合體，最終引發(fā)細(xì)胞自噬，故Beclin-1的表達(dá)高低與自噬密切相關(guān)。而3-甲基腺嘌呤(3-MA)是PI3K class Ⅲ特異性抑制劑，通過(guò)阻止PI3K class Ⅲ-VPS15-Beclin1復(fù)合體的形成從而抑制自噬的進(jìn)行。LC3作為自噬的標(biāo)志性蛋白，尤其是自噬時(shí)，自噬小體內(nèi)膜上的LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)顯著上升，因此其表達(dá)水平可有效反映細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量[14]。而p62可與LC3Ⅱ形成復(fù)合體而削弱LC3 Ⅱ的活性，同時(shí)，p62蛋白本身又受自噬作用的調(diào)節(jié)，其表達(dá)與細(xì)胞自噬活性呈負(fù)相關(guān)[15]，因此，通過(guò)對(duì)自噬上游蛋白AMPK、mTOR磷酸化情況以及Beclin-1、LC3 Ⅱ、p62等自噬通路效應(yīng)蛋白的檢測(cè)，可以對(duì)低氧/復(fù)氧后AECⅡ的自噬情況有較為全面的了解。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，其余各組的細(xì)胞活力均有下降，電鏡下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的紊亂，尤其以H/R、DMSO、Rap組為甚，表現(xiàn)為高度的線粒體水腫，線粒體嵴線模糊甚至消失，板層小體內(nèi)容物有減少甚至形成空泡，同時(shí)可見(jiàn)自噬小體結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，均表明低氧/復(fù)氧會(huì)引起細(xì)胞損傷加重。

而應(yīng)用3-MA進(jìn)行干預(yù)時(shí)，細(xì)胞活力有所回升，細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷也大大減輕，并且未觀察到自噬小體。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，低氧/復(fù)氧可使細(xì)胞中AMPK、Beclin-1、LC3蛋白的基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平上升，同時(shí)mTOR蛋白和p62蛋白的基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)則有所降低，而應(yīng)用了自噬抑制劑3-MA后AMPK、Beclin1、LC3 表達(dá)下降，mTOR和p62表達(dá)上升，這說(shuō)明低氧/復(fù)氧時(shí)，蛋白和基因?qū)用婢屑?xì)胞自噬水平上升，而使用自噬抑制劑可降低自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。

綜上所述，低氧/復(fù)氧可增強(qiáng)細(xì)胞自噬引起大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷；使用自噬抑制劑(3-MA)抑制自噬后，可一定程度上減輕Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞低氧/復(fù)氧損傷。