董莉麗，馮 磊，楊 然，李 松，饒玉梅

(1.南陽市中心醫(yī)院 婦科，河南 南陽 473000;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦科，河南 鄭州 450000)

卵巢癌(ovarian cancer)是婦科常見3大惡性腫瘤之一，過去10年間，中國卵巢癌發(fā)病趨于年輕化，發(fā)病率增長30%，病死率增加18%[1]。由于卵巢癌發(fā)病隱匿且缺少確切前期診斷方式，70%以上確診時已進入中晚期，多數(shù)發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)機會，僅能采取放射治療、化學(xué)藥物治療等姑息治療措施，預(yù)后差[2]。因此，探索抑制卵巢癌細胞遷移和侵襲的有效方式，對改善其預(yù)后有重要意義。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白29(endoplasmic reticulum protein 29，ERP29)是影響細胞增殖、轉(zhuǎn)移的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白之一，在多種腫瘤細胞中異常表達，參與乳腺癌、肺腺癌及結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展[3-5]。本課題組經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)ERP29在卵巢癌組織中異常低表達，ERP29可能作為抑癌基因參與發(fā)病進程，但關(guān)于其對卵巢癌細胞侵襲、遷移的影響及具體機制仍需進一步探討。本研究建立過表達ERP29的OVCAR3細胞系，探討其對細胞遷移、侵襲的影響，并探討相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系:人卵巢癌細胞系OVCAR3(中國科學(xué)院上海細胞庫)，保存于液氮中。

1.1.2 主要試劑:攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的真核表達載體pcDNA3.1-ERP29質(zhì)粒、陰性對照載體pcDNA3.1 empty質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；LipofectamineTM2000試劑盒(Invitrogen公司)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time-quantitative-polymerase chain reaction，RT-qPCR)SYBR Ⅱ試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量分析試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、p-AKT、雷帕霉素靶蛋白(mam-malian target of rapamycin，mTOR)、p-mTOR、真核生物始動因子4E結(jié)合蛋白1(4E binding protein，4EBP1)、p-4EBP1一抗(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組：將OVCAR3細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中(10%胎牛血清+1%抗青霉素、鏈霉素混合液)，常規(guī)條件5% CO2、37 ℃下培養(yǎng)至對數(shù)期行后續(xù)實驗。調(diào)整細胞濃度為1×105個/mL，重新接種至6孔板，待細胞再次匯合至70%時，按LipofactamineTM2000試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染。分為過表達組、空載組、對照組。過表達組用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染ERP29過表達RNA重組真核載體pcDNA 3.1-ERP29質(zhì)粒，空載體組轉(zhuǎn)染陰性對照載體pcDNA 3.1 empty質(zhì)粒，對照組不做處理。3組均設(shè)5個復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)6 h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 RT-qPCR檢測細胞中ERP29 mRNA表達量：取各組細胞，經(jīng)PBS洗滌用Trizal法提取細胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得對應(yīng)的互補RNA(complementary RNA,cRNA)，定量后按熒光定量試劑盒說明書要求設(shè)置反應(yīng)體系：上、下游引物(終濃度0.2 μmol/L)1.0 μL，2×Power qPCR PreMix 10 μL，DNA模板2.0 μL，加雙蒸水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。β-actin為內(nèi)參基因，2-△△Ct法計算。引物序列：5′-TGCAGTGCAGTGC ACGCATGCTCA-3′(F)，5′-GTGCACACGGTTGTGTC CACCAAC-3′(R)。

1.2.3 Transwell小室實驗測定細胞侵襲：將Matrigel(1∶9稀釋)預(yù)先鋪設(shè)于孔徑8 μm、24孔趨化板Transwell小室中，恒溫箱內(nèi)膠干，取各組細胞無血清培養(yǎng)基上清液(培養(yǎng)24 h后)，下、上室中加入各組單細胞懸液，同條件培養(yǎng)24 h，取杯底濾膜，加入結(jié)晶紫避光染色、4 %多聚甲醛固定。取5個隨機視野，顯微鏡下觀察并記錄穿膜細胞數(shù)。

1.2.4 劃痕實驗測定細胞遷移：胰蛋白酶消化重懸，調(diào)整細胞為1×105個/mL，接種至6孔板，細胞增殖至貼壁棄去培養(yǎng)基，用無菌槍頭在孔中間畫一條直線，用PBS沖洗直線邊緣細胞至脫落，拍照記錄初始劃痕距離，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，拍照記錄新劃痕距離，計算出各組遷移率。遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.5 Western blot測定細胞中AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、4EBP1和p-4EBP1蛋白表達：用PBS沖洗，加入預(yù)冷RIPA裂解液，靜置10 min后離心，BCA法測蛋白總量。沸水浴5 min使蛋白變性，取50 μg樣本混合上樣緩沖液，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，加入5%脫脂奶粉封閉1 h，加入AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、4EBP1和p-4EBP1一抗(1∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌3次，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶8 000)，室溫孵育2 h后放入暗室顯色、曝光，用Image J軟件分析吸光度值，目的基因條帶吸光度/內(nèi)參β-actin條帶吸光度即為蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率的測試

過表達組、空載組均有GFP綠色熒光蛋白表達，轉(zhuǎn)染效率均大于80%，可用于后續(xù)實驗(圖1)。

圖1 過表達組與空載體組轉(zhuǎn)染效率觀察Fig 1 Transfection efficiency of over-expression and empty vector groups

2.2 轉(zhuǎn)染后各組ERP29 mRNA相對表達量對比

與對照組和空載組對比，過表達組ERP29 mRNA相對表達量升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組ERP29表達水平Table 1 ERP29 expression levels in each

2.3 各組細胞侵襲能力對比

與對照組和空載組對比，過表達組穿膜細胞數(shù)減少(P<0.05)(表2,圖2)。

圖2 Transwell小室法觀察各組穿膜細胞數(shù)Fig 2 Transwell experiment observation of the number of transmembrane cells in each group

表2 各組穿膜細胞數(shù)對比Table 2 Comparison of the number of penetrating cells

2.4 各組細胞遷移能力對比

與對照組、空載組對比，過表達組遷移率降低(P<0.05)(圖3,表3)。

圖3 劃痕實驗觀察各組遷移能力Fig 3 Scratch experiment to observe the migration ability of each groups(×100)

表3 各組細胞遷移能力對比Table 3 Comparison of cell migration ability of each

2.5 各組細胞p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1值對比

與對照組、空載體組對比，過表達組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1值降低(P<0.05)(圖4，表4)。

圖4 Western blot實驗測定AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白表達量Fig 4 Western blot experiment to determine the protein expression of AKT,p-AKT,mTOR,p-mTOR, 4EBP1,p-4EBP1

表4 各組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1值對比Table 4 Comparison of p-AKT/AKT,p-mTOR/mTOR,p-4EBP1/4EBP1 values in each group

3 討論

卵巢癌惡性程度極高，病死率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首[6]。關(guān)于其機制尚未完全闡明，通常認(rèn)為與基因突變、遺傳因子不穩(wěn)定及基因異常表達有關(guān)[7-8]。目前,腫瘤細胞減滅手術(shù)輔以聯(lián)合化學(xué)藥物治療(簡稱化療)是卵巢癌的主要治療方式，患者生存率得以提高，然而由于化療耐藥性的存在，5年生存率仍不足30%[9]。癌細胞的侵襲和遷移是導(dǎo)致治療失敗及患者死亡的主因。因此，探索抑制卵巢癌細胞侵襲遷移能力的有效方法至關(guān)重要。

ERP29最早在大鼠牙釉質(zhì)細胞被發(fā)現(xiàn)，廣泛分布于各種組織器官。ERP29作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白參與非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)，促使新生蛋白向正確的空間結(jié)構(gòu)折疊，并有助于因應(yīng)激而失活的蛋白質(zhì)恢復(fù)正常，其上調(diào)可抑制細胞的遷移和侵襲能力，而下調(diào)具有相反作用，可通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程、影響Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑來阻止細胞轉(zhuǎn)移。卵巢癌細胞中ERP29表達顯著低于臨近非腫瘤組織，且表達水平與腫瘤病理特征具有相關(guān)性，提示ERP29在卵巢癌細胞中低表達，參與卵巢癌進程[10]。本研究結(jié)果顯示，與對照組和空載體組比較，過表達組ERP29表達升高，穿膜細胞數(shù)減少，遷移率降低，提示ERP29過表達可顯著抑制OVCAR3細胞侵襲、遷移，與報道的結(jié)論相似[11]。

AKT/mTOR信號通路是細胞增殖的關(guān)鍵信號通路，廣泛存在于各種細胞中，研究認(rèn)為其活性異常增強與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系[12]。AKT是一種高度保守的絲氨酸蘇氨酸蛋白酶，是維持細胞正常功能的關(guān)鍵信號分子，通過磷酸化為p-AKT被激活。mTOR蛋白是絲氨酸蘇氨酸蛋白酶，是AKT下游重要靶點之一，被p-AKT激活后通過調(diào)控真核起始結(jié)合蛋白4EBP1，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成從而影響細胞增殖。AKT/mTOR信號通路異常高表達于卵巢癌中[13]，采取對應(yīng)干預(yù)措施使該通路失活，可減弱卵巢癌的惡性生物學(xué)特性。本研究結(jié)果顯示，與對照組、空載組相比，過表達組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-4EBP1/4EBP1值降低，提示上調(diào)ERP29對卵巢癌細胞侵襲、遷移能力的抑制作用可能與下調(diào)AKT、mTOR、4EBP1磷酸化有關(guān)。

綜上所述，過表達ERP29可抑制卵巢癌細胞系侵襲、遷移，可能通過下調(diào)AKT、mTOR、4EBP1磷酸化發(fā)揮作用。本研究仍存在一定不足，在實驗條件的限制下僅通過單一細胞系研究ERP29的作用略顯牽強，在后續(xù)實驗中將采用病毒感染或增加對照實驗的方式進行更為深入的探索。