高 靜，周家奇

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院 麻醉科，浙江 杭州 310000；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 杭州 310000)

肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)是在慢性肝病和/或門脈高壓的基礎(chǔ)上出現(xiàn)肺內(nèi)微血管異常擴(kuò)張(intrapulmonary vascular dilation,IPVD)、血管新生而導(dǎo)致的氧合異常綜合征，也是引起圍術(shù)期移植肝無功能及肺部感染的主要原因[1-3]。既往研究認(rèn)為肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)的異常增殖、遷移引起肺血管重塑在其中發(fā)揮了重要作用[4-5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)脂筏(lipid raft)在血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖和遷移過程中發(fā)揮了重要重用，但其確切機(jī)制不清。本研究發(fā)現(xiàn)脂筏內(nèi)integrin β1通過激活integrin β1/FAK通路進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和血管內(nèi)皮生成因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的分泌，可能介導(dǎo)了肝肺綜合征的肺血管重塑過程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大鼠及細(xì)胞：雄性SD大鼠(SPF級(jí)，250～300 g/只，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心)；原代大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Cell Biologics公司)。

1.1.2 試劑及試劑盒：CCK-8試劑、甲基-β-環(huán)糊精(MβCD)(Sigma-Aldrich公司)；ECM培養(yǎng)基(Science Cell公司)；胰蛋白酶(Gibco公司)；DMSO(國產(chǎn)分析純)、VEGF-ELISA試劑盒(依科賽公司)，青霉素-鏈霉素溶液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、HRP標(biāo)記兔抗山羊二抗、抗 FAK 鼠單克隆抗體和抗 pY397FAK 兔單克隆抗體(北京康為生物科技有限公司)，EntransterTM-R(北京英格恩生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 HPS大鼠血清的制備：腹腔注射3%戊巴比妥鈉 (0.1 mL/100 g)麻醉，沿腹正中進(jìn)腹，暴露并充分游離膽總管，分別在近肝門處和近十二指腸處結(jié)扎并剪斷，關(guān)腹[4]。建模后4周在無菌操作下抽取腹主動(dòng)脈血，4 ℃離心取上清，56 ℃加熱30 min以滅活補(bǔ)體，-80 ℃保存。

1.2.2 細(xì)胞的分組及處理：將PMVECs分為：1)對(duì)照組：10%健康大鼠血清刺激組；2)HPS組：10%肝肺綜合征大鼠血清刺激組；3)MβCD組：事先用0.01 mol/L MβCD預(yù)處理細(xì)胞1 h；4)si-integrin β1敲低組：利用siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染靶向敲低integrin β1基因。體外合成特異性 integrin β1 siRNA，轉(zhuǎn)染前1天將1×106個(gè)PMVECs接種于100 mm培養(yǎng)皿，加入10 mL全培養(yǎng)基。取1個(gè)離心管加入20 μg RNA，然后加入無血清 DMEM 充分混勻，制成250 μL的RNA 稀釋液，另取1個(gè)離心管，加入EntransterTM-R 60 μL，然后加入190 μL無血清DMEM，充分混勻，制成 250 μL的EntransterTM-R稀釋液，室溫靜置5 min。將EntransterTM-R稀釋液加入到RNA稀釋液，立即充分混勻。轉(zhuǎn)染后6 h觀察細(xì)胞狀態(tài)。培養(yǎng)24 h后檢測mRNA水平，48 h后檢測蛋白表達(dá)水平評(píng)價(jià)siRNA轉(zhuǎn)染后integrin β1的沉默效率。后3組用10%肝肺綜合征大鼠血清的ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)。孵育48 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 脂筏提?。翰捎妹芏忍荻入x心分離法提取脂筏。收集細(xì)胞，加入裂解液，4 ℃靜置30 min，配置密度梯度，調(diào)節(jié)細(xì)胞裂解物至40% OptiPrep，密封在含有30%和10%的OptiPrep提取緩沖液中，可見明顯分層，然后4 ℃，35 000×g離心16 h，片段由等體積的去污劑不溶性富含糖脂復(fù)合體(detergent insoluble glycolipid rich complex,DIG)和非等體積的DIG組成，收集非DIG，免疫印跡檢測，顯影目標(biāo)蛋白條帶。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)：收集細(xì)胞，加入改進(jìn)RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000×g離心10 min，取上清并測定其濃度后，SDS-PAGE分離轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育4 ℃過夜，含0.05% Tween TBS洗膜5 min×3次，二抗孵育2 h，TBS液洗膜3次，化學(xué)發(fā)光劑于暗室中顯影并感光，圖像定量分析。

1.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：1)細(xì)胞接種：96孔板中均勻接種100 μL細(xì)胞懸液。放培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(37 ℃，5% CO2)。2)處理：向孔板中加入10 μL不同的待測物質(zhì)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24、48 h。3)加CCK溶液：向孔板中加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h。4)用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度值。

1.2.6 細(xì)胞遷移的測定：將蓋玻片置于6孔培養(yǎng)板中，接種傳代培養(yǎng)PMVECs，細(xì)胞匯合后，取出蓋玻片，顯微鏡下用無菌細(xì)胞刮刀將蓋玻片上的細(xì)胞沿直線刮除一側(cè)，放入培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，以測定遷移最遠(yuǎn)的PMVECs至刮線邊緣的距離為細(xì)胞的遷移距離。每組觀察16個(gè)蓋玻片的細(xì)胞遷移距離，取均值。

1.2.7 測定上清VEGF濃度：以ELISA檢測各組VEGF濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝肺綜合征血清刺激integrin β1脂筏聚集

脂筏區(qū)域(raft)：與對(duì)照組比較，HPS組脂筏內(nèi)的integrin β1表達(dá)顯著增加(P<0.05)；而在給予脂筏解離劑MβCD后，對(duì)照組和HPS組脂筏內(nèi)的integrin β1表達(dá)顯著降低(P<0.05)；非脂筏區(qū)域(non-raft)：與對(duì)照組比較，HPS組脂筏外integrin β1表達(dá)有所減少(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with HPS group圖1 肝肺綜合征大鼠血清對(duì)細(xì)胞脂筏內(nèi)外integrin β1表達(dá)的影響Fig 1 Effect of HPS rat serum on integrin β1 inside and outside lipid

2.2 脂筏內(nèi)integrin β1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)FAK磷酸化

與對(duì)照組相比，HPS組pY397FAK磷酸化水平顯著升高(P<0.05)；與HPS組相比，MβCD組和si-integrin β1組pY397FAK磷酸化水平受到顯著抑制(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with HPS group圖2 脂筏內(nèi)integrin β1聚集對(duì)細(xì)胞FAK活性變化的影響Fig 2 Effect of integrin β1 gathered within lipid rafts on the activity of FAK among different groups

2.3 脂筏內(nèi)integrin β1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了肝肺綜合征血清誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖

與對(duì)照組相比，HPS組細(xì)胞增殖能力在24和48 h時(shí)增強(qiáng)(P<0.05)；與HPS組相比，MβCD組和si-integrin β1組細(xì)胞增殖能力在24和48 h時(shí)顯著減弱(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with HPS group圖3 脂筏內(nèi)integrin β1聚集對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig 3 Effect of integrin β1 gathered within lipid rafts on cell proliferation among different

2.4 脂筏內(nèi)integrin β1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了肝肺綜合征血清誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移

與對(duì)照組相比，HPS組細(xì)胞遷移距離在24和48 h時(shí)增強(qiáng)(P<0.05)；與HPS組相比，MβCD組和si-integrin β1組細(xì)胞遷移距離在24和48 h時(shí)顯著減弱(P<0.05)(圖4)。

arrow shows cell migration distance;*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with HPS group圖4 脂筏內(nèi)integrin β1聚集對(duì)細(xì)胞遷移的影響Fig 4 Effect of integrin β1 gathered within lipid rafts on cell migration among different

2.5 脂筏內(nèi)integrin β1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了肝肺綜合征血清誘導(dǎo)VEGF表達(dá)

與對(duì)照組相比，HPS組細(xì)胞VEGF分泌水平在24和48 h時(shí)增強(qiáng)(P<0.05)；與HPS組相比，MβCD組和si-integrin β1組細(xì)胞VEGF分泌水平在24和48 h時(shí)顯著減弱(P<0.05)(表1)。

表1 脂筏內(nèi)integrin β1聚集對(duì)細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響Table 1 Effect of integrin β1 gathered within lipid rafts on the expression of VEGF among different

3 討論

盡管HPS的研究逐漸成為研究熱點(diǎn)，但是臨床上仍缺乏有效的防治手段，對(duì)HPS分子機(jī)制的深入研究可為HPS的防治提供有效途徑[1，6]。目前的研究認(rèn)為HPS的病理過程為原發(fā)肝病-肺微血管重塑-低氧血癥三聯(lián)征，其中以肺微血管重塑為主要病理改變[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)PMVECs 的異常增殖、遷移可能發(fā)揮了作用，但確切機(jī)制尚待進(jìn)一步研究[8-9]。

Integrin β1主要介導(dǎo)細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的連接，并影響胞外信號(hào)向胞內(nèi)的傳遞；在細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[10-12]。脂筏是細(xì)胞膜上富含鞘磷脂和膽固醇的液態(tài)微區(qū)，大量的蛋白和脂類分子富集于此，成為膜動(dòng)態(tài)變化和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的平臺(tái)。早期的研究認(rèn)為integrin并不定位在脂筏上，但近年的研究發(fā)現(xiàn)，integrin不僅能定位在脂筏區(qū)域，而且其功能的發(fā)揮還受到脂筏影響[12]。本研究發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組比較，HPS組脂筏內(nèi)的integrin β1表達(dá)上調(diào)；用MβCD擾亂脂筏結(jié)構(gòu)，可以有效阻止脂筏內(nèi)integrin β1的表達(dá)，表明脂筏內(nèi)integrin β1的表達(dá)依賴于脂筏結(jié)構(gòu)的完整性。

黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑的交匯點(diǎn)，激活下游多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑[13-14]。HPS患者肝臟解毒功能下降，有害代謝產(chǎn)物，在細(xì)胞炎性因子等刺激下，胞質(zhì)中的FAK可靶向到細(xì)胞膜，并定位到脂筏內(nèi)，活化的FAK進(jìn)而激活Ras-MAPK、PI3K和STAT等多條信號(hào)傳導(dǎo)通路[15]。本研究發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組比較，HPS組FAK活化水平顯著增高，細(xì)胞增殖、遷移和VEGF分泌顯著增加；而在給予脂筏解離劑MβCD或小干擾RNA敲低integrin β1表達(dá)后，F(xiàn)AK活化水平受到顯著抑制，細(xì)胞增殖、遷移和VEGF分泌顯著降低，表明肝肺綜合征血清通過誘導(dǎo)脂筏內(nèi)integrin β1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而增加pY397FAK活化水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和VEGF分泌。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)脂筏內(nèi)integrin β1表達(dá)上調(diào)通過激活 integrin β1/FAK通路進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和VEGF分泌，可能介導(dǎo)了肝肺綜合征的肺微血管重塑，有望成為臨床治療的潛在靶點(diǎn)。