陳邦盛，余小玲，毛飛燕，廉姜芳，俞徐云*

(1.寧波市鄞州第二醫(yī)院 急救醫(yī)學(xué)中心，浙江 寧波 315192；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院(寧波市第二醫(yī)院)普外科，浙江 寧波 315010；3.寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院興寧院區(qū) 心血管內(nèi)科，浙江 寧波 315040)

遺傳性長(zhǎng)QT綜合征(hereditary long QT syndrome，hLQTS)是一組編碼心肌復(fù)極化離子通道HERG(human ether-à-go-go related gene,hERG)基因突變而導(dǎo)致的一種遺傳性離子通道病，臨床上以QT間期延長(zhǎng)、尖端扭轉(zhuǎn)型室速、暈厥甚至猝死為主要表現(xiàn)[1-2]。研究表明，hLQTS的發(fā)病機(jī)制是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制系統(tǒng)使錯(cuò)誤折疊的hERG變異體滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)致細(xì)胞膜成熟hERG鉀通道蛋白減少[3]。在多肽鏈折疊轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，分子伴侶常識(shí)別并結(jié)合于折疊中間產(chǎn)物的疏水端，防止多肽鏈異常聚集，直至其折疊成為正確或相對(duì)正確結(jié)構(gòu)才與之分離[4]，目前對(duì)于分子伴侶輔助新生蛋白折疊轉(zhuǎn)運(yùn)的研究多集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域，近期研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后質(zhì)量控制系統(tǒng)在相關(guān)的構(gòu)象疾病中發(fā)揮重要作用[5]，但對(duì)疾病的潛在影響尚不清楚，Rer1是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基中間體(ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC)的分子伴侶[6]，其在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮一定作用，但對(duì)hERG鉀通道的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制仍不明確。本研究利用免疫熒光、免疫印跡及膜片鉗等方法，探究Rer1在hERG鉀通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用，從而為hLQTS發(fā)病機(jī)制的研究提供一個(gè)新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎腎上皮細(xì)胞系(HEK293T)和質(zhì)粒pcDNA3-hERG、pcDNA3-hERG-A561V(寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone公司)；Rer1(山羊來源)一抗(Novusbio公司)；HERG(兔來源)一抗(Alomone公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；Baf A1(Abcam公司)；siRNA-Rer1質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P基因公司合成)；質(zhì)粒中提試劑盒(Omega公司)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的制備及細(xì)胞的培養(yǎng)：擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，測(cè)DNA濃度和純度。復(fù)蘇HEK293T細(xì)胞后，按比例接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，加入高糖DMEM 4 mL，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2 細(xì)胞模型的分組構(gòu)建及處理：將HEK293T細(xì)胞按2×105個(gè)/mL的濃度接種在有蓋玻片的60 mm培養(yǎng)皿中，待匯合至90%左右，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3-WT-HERG、pcDNA3-A561V-HERG、pcDNA3-WT/A56lV-HERG各2.5 μg構(gòu)建野生、突變及混合轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型。

1.2.3 Western blot檢測(cè)各組hERG及Rer1蛋白的表達(dá)：培養(yǎng)各組細(xì)胞48 h后提取蛋白并BCA法測(cè)濃度，配制12% SDS-PAGE分離膠，電泳1.5 h后轉(zhuǎn)膜，隨后用5%的脫脂奶粉封閉1 h并用TBST洗4次，分別加一抗(HERG 1∶400；Rer1 1∶200)后4 ℃冰箱過夜。次日吸出一抗，TBST清洗后加用二抗(tubulin 1∶1 000)孵育1 h后進(jìn)行曝光，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用image J軟件定量分析。

1.2.4 免疫熒光檢測(cè)各組hERG蛋白的表達(dá)：采用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞，PBS浸洗后用0.5% Triton X-100室溫通透20 min，再次浸洗后滴加5% BSA，37 ℃封閉30 min，棄封閉液，培養(yǎng)皿中滴加足量的一抗HERG(1∶25)，4 ℃孵育過夜；次日吸干液體后滴加熒光二抗Cy3(1∶200)，37 ℃孵育30 min后滴加DAPI避光孵育5 min，用20%甘油封閉培養(yǎng)皿，熒光顯微鏡觀察采集圖像。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Rer1敲低后hERG蛋白的表達(dá)：在構(gòu)建的各組細(xì)胞中分別加入siRNA-Rer1及scramble質(zhì)粒共9組，繼續(xù)培養(yǎng)各組細(xì)胞48 h后提取蛋白并采用Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平(步驟同1.2.3)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)Baf A1孵育后hERG蛋白的表達(dá)：培養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)建各細(xì)胞模型，采用Baf A1以1 mmol/L的濃度進(jìn)行孵育6 h，Western blot檢測(cè)hERG的表達(dá)(步驟同1.2.3)。

1.2.7 膜片鉗技術(shù)記錄Baf A1孵育前后混轉(zhuǎn)細(xì)胞的電流：消化各組細(xì)胞并待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后選取熒光度強(qiáng)、細(xì)胞表面光滑、狀態(tài)佳的細(xì)胞，通過顯微操縱儀使電極尖端與細(xì)胞膜形成巨阻抗封接，待阻抗達(dá)1 GΩ以上，撤除負(fù)壓后給予破膜，并使破膜后電阻亦維持在1 GΩ以上，記錄各細(xì)胞電容。維持鉗制電壓-80 mV，測(cè)試電壓從-60 mV開始，以10 mV為階躍，刺激至+60 mV，然后復(fù)極化到-40 mV，持續(xù)4 s,繼之回到-80 mV，尾電流在-40 mV期間獲得。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hERG及Rer1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

野生組hERG蛋白表達(dá)未成熟的135 ku及成熟的155 ku蛋白，A561V突變組表達(dá)135 ku蛋白及極少量155 ku蛋白，混轉(zhuǎn)組則以表達(dá)未成熟的135 ku蛋白為主，并部分表達(dá)155 ku蛋白。與野生組相比，混轉(zhuǎn)組未成熟hERG蛋白明顯升高(P<0.01)，突變組則明顯減低(P<0.05)；而成熟hERG蛋白在突變組顯著下調(diào)(P<0.01)(圖1A，B)。此外，Rer1是一種分子質(zhì)量為23 ku高爾基體側(cè)的分類受體，相對(duì)于野生組，Rer1的表達(dá)量在突變組及混轉(zhuǎn)組中明顯降低(P<0.01)(圖1C，D)。

A.hERG expression detected by Western blot；B.relative expression of hERG；*P<0.05，**P<0.01 compared with WT group in 135 ku group；#P<0.01 compared with WT group in 155 ku group；C.Rer1 expression detected by Western blot；D.relative expression of Rer1，**P<0.01 compared with WT group

2.2 免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)hERG的表達(dá)

A561V突變組與對(duì)照組及野生組相比細(xì)胞分布明顯減少、細(xì)胞聚集成團(tuán)，且突變組hERG蛋白在細(xì)胞質(zhì)中明顯聚集，而其余幾組均有細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)的定位，在融合圖像中，混轉(zhuǎn)組與野生組相比，hERG蛋白的膜表達(dá)有所減少(綠色熒光代表hERG，藍(lán)色熒光代表核染色)(圖2)。

圖2 免疫熒光染色分析各組hERG蛋白的表達(dá)Fig 2 Analysis of hERG expression by immunofluorescence staining in each (×200，scale bar=100 μm)

2.3 Rer1參與hERG蛋白的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)并抑制其順向轉(zhuǎn)運(yùn)

與空白對(duì)照組相比，采用小干擾RNA技術(shù)成功敲低Rer1表達(dá)水平后(圖3A)，各組細(xì)胞中未成熟hERG蛋白對(duì)于Rer1的下調(diào)并不十分敏感，此外，與scramble對(duì)照組相比，僅混轉(zhuǎn)組出現(xiàn)未成熟hERG蛋白的減低，但無顯著性差異(圖3B)；而相對(duì)于空白組，各組細(xì)胞中成熟hERG蛋白的表達(dá)均有一定水平的增加，在野生組中成熟hERG蛋白明顯增加(P<0.05)，同時(shí)，與scramble對(duì)照組相比，野生組成熟hERG蛋白表達(dá)亦明顯增加(P<0.05)(圖3C)。

2.4 Baf A1孵育促進(jìn)hERG蛋白細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)

與對(duì)照組相比，在采用Baf A1孵育后混轉(zhuǎn)組未成熟hERG蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)(圖4A,B)；此外，野生及突變組成熟hERG蛋白的表達(dá)在Baf A1孵育后顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而混轉(zhuǎn)組成熟hERG蛋白并無顯著差異(圖4A,C)。

2.5 Baf A1孵育混轉(zhuǎn)細(xì)胞后增強(qiáng)hERG尾電流

混轉(zhuǎn)組細(xì)胞未進(jìn)行Baf A1孵育時(shí)，尾電流較小，而采用Baf A1進(jìn)行孵育后，電流密度得到明顯增強(qiáng)，并且激活電壓從-20 mV到60 mV，混轉(zhuǎn)細(xì)胞中Baf A1孵育組細(xì)胞株尾電流相對(duì)電流密度明顯高于混轉(zhuǎn)對(duì)照組(P<0.05)(圖5)。

scr-siRNA.scramble-siRNA；A.knockdown of Rer1 on expression of hERG was detected by Western blot；B.relative expression of 135 ku hERG；C.relative expression of 155 ku hERG；*P<0.05 compared with blank control group;#P<0.05 compared with scramble control group

A.expression of hERG was detected by Western blot under treated with or without Baf A1；B.relative expression of 135 ku hERG；C.relative expression of 155 ku hERG；*P<0.05 compared with control

3 討論

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)異常致未成熟hERG蛋白滯留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是hLQTS的主要致病機(jī)制，異常蛋白的滯留引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并觸發(fā)未折疊蛋白形成[7-8],有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后區(qū)室的分子伴侶是蛋白質(zhì)早期分泌途徑的重要質(zhì)量控制因子[9]，因此，深入探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后區(qū)室分子伴侶與hLQTS的內(nèi)在機(jī)制，對(duì)于hLQTS發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義。

Rer1是一個(gè)典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后區(qū)室分子伴侶，已證實(shí)Rer1參與γ-分泌酶的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，下調(diào)Rer1可以削弱Notch信號(hào)并導(dǎo)致小鼠大腦皮層發(fā)育受損[10]。此外，F(xiàn)et3p、Secl2p、Mns1p和Sec71p等多種蛋白也可在Rer1p的作用下被逆轉(zhuǎn)運(yùn)回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[11]。但是，Rer1在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)異常致hLQTS的研究尚無相關(guān)報(bào)道。本研究采用HEK293T細(xì)胞構(gòu)建野生、突變、混轉(zhuǎn)細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)A561V突變可致hERG蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)異常并使Rer1表達(dá)明顯減低，而小干擾 RNA(siRNA)敲低Rer1表達(dá)可促進(jìn)部分相對(duì)成熟hERG蛋白的順向轉(zhuǎn)運(yùn)，表明Rer1參與了hERG通道蛋白的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)而且對(duì)于異常蛋白可能起較強(qiáng)的識(shí)別及逆轉(zhuǎn)運(yùn)作用，從而保證了分泌蛋白的正確構(gòu)象。

A,B.representative IhERG recordings respectively under Baf A1 treated and untreated conditions;C.mean normalized tail current data for each expression conditionare plotted following each command pulse

研究證實(shí)混轉(zhuǎn)型通道蛋白并非功能完全喪失，錯(cuò)誤折疊但部分功能蛋白的過早降解是導(dǎo)致LQTS和囊性纖維化等構(gòu)象病的致病機(jī)制[5]，若能正常轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜仍能發(fā)揮一定的代償功能[12]。既往研究表明，高濃度的Baf A1可以抑制蛋白從高爾基體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)[13]，這與敲低Rer1表達(dá)有類似作用。在本研究中，采用Baf A1孵育可使野生及突變組成熟hERG蛋白明顯增加，而混轉(zhuǎn)組則僅僅表現(xiàn)為未成熟hERG蛋白顯著上調(diào)，為此，進(jìn)一步通過膜片鉗對(duì)有潛在功能的混轉(zhuǎn)細(xì)胞檢測(cè)膜電流，發(fā)現(xiàn)Baf A1孵育后尾電流密度明顯強(qiáng)于對(duì)照組，這表明Baf A1雖然不能使混轉(zhuǎn)組成熟hERG蛋白的表達(dá)增加，但仍可增強(qiáng)混轉(zhuǎn)組細(xì)胞膜上的尾電流，出現(xiàn)這種結(jié)果的可能原因是Baf A1抑制了核內(nèi)體的內(nèi)吞從而導(dǎo)致混轉(zhuǎn)組未成熟hERG蛋白的顯著增加，但Baf A1同時(shí)也增強(qiáng)了混轉(zhuǎn)組hERG鉀離子通道蛋白的質(zhì)膜循環(huán)從而導(dǎo)致膜電流增加。

綜上所述，分子伴侶Rer1主要通過介導(dǎo)蛋白的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)參與hERG鉀通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，而敲低Rer1可以促進(jìn)蛋白的順向轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，對(duì)于有潛在功能的混轉(zhuǎn)型細(xì)胞Baf A1可以恢復(fù)hERG鉀通道的膜電流，這也為hLQTS發(fā)病機(jī)制的研究提供了一種新的思路。