薛孝斌，劉剛，任冬莉

西安市長(zhǎng)安區(qū)醫(yī)院普通外科1、腫瘤科2、麻醉科3，陜西 西安 710100

胃癌是目前國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，我國(guó)胃癌病例每年新增超40 萬(wàn)，患病率位居癌癥患病率第二，死亡率位居癌癥死亡率第三[1-2]。胃癌臨床進(jìn)展較快，中晚期多出現(xiàn)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，根治術(shù)術(shù)后引起胃腸功能倒退常出現(xiàn)乏力、惡心和嘔吐等不良反應(yīng)，故胃癌預(yù)后較差，中晚期多采用保守藥物治療，探索其發(fā)病機(jī)制，找出影響病情進(jìn)展主要節(jié)點(diǎn)并及時(shí)干預(yù)對(duì)控制胃癌轉(zhuǎn)移、改善患者預(yù)后有重要意義[3-4]。鋅指蛋白(zinc finger protein，ZNF)結(jié)構(gòu)特殊，可與DNA、蛋白質(zhì)等大分子相結(jié)合或ZNF-ZNF 相互結(jié)合進(jìn)而參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[5]。ZNF139屬于ZNF家族，可通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)進(jìn)而參與細(xì)胞分化，與腫瘤分化轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，研究指出ZNF139能調(diào)節(jié)食管-胃交界腺癌腫瘤細(xì)胞增殖，在癌組織高表達(dá)[6]。腫瘤細(xì)胞增生對(duì)血供需求較高，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)高表達(dá)可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞大量增殖、加快血管新生進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移[7]。研究指出VEGF 高表達(dá)可介導(dǎo)肺癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并參與結(jié)腸癌患者淋巴管生成并促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[8]。因此，ZNF139 和VEGF 表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究?jī)烧弑磉_(dá)與胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)系可為臨床胃癌治療藥物研發(fā)提供一定思路。 盡管ZNF139和VEGF表達(dá)與胃癌發(fā)生相關(guān)研究較多，但有關(guān)兩者表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系研究較少，為此本研究將圍繞這一重點(diǎn)開(kāi)展研究，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2019 年2 月至2020 年8 月間在西安市長(zhǎng)安區(qū)醫(yī)院治療且符合以下納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的78例胃癌手術(shù)患者，所有患者均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查為腺癌，其中42例伴區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者均取得相應(yīng)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織。78 例患者中男性44 例，女性34例；年齡38～75歲，平均(57.25±9.26)歲；腫瘤分化程度：低分化30 例、高分化48 例；據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)對(duì)胃癌的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[9]分為Ⅰ～Ⅲ期，其中Ⅰ期16例，Ⅱ期23例，Ⅲ期39例；腫瘤直徑≤5 cm者45例、直徑>5 cm者33例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者42例。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：患者為初次發(fā)病，年齡≥18歲；參照相關(guān)指南[10]標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理檢查確診為胃腺癌；均行手術(shù)治療且愿意配合術(shù)中病理組織留樣；術(shù)前無(wú)抗腫瘤治療既往史；研究獲患者知悉同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：病情危重者；伴其他部位惡性腫瘤者；伴先天性疾病及心、肺、肝、腎等嚴(yán)重器質(zhì)性障礙者；伴嚴(yán)重免疫系統(tǒng)疾病者。

1.3 方法

1.3.1 ZNF139、VEGF 檢測(cè)將分離組織的石蠟切片切為厚4.0 μm/片的薄片，脫蠟后通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法將標(biāo)本染色。首先用0.50%高錳酸鉀浸泡水洗5～20 min，再用1.0%草酸浸泡2～5 min實(shí)現(xiàn)脫色(通過(guò)癌組織大小和鏡下觀察脫色度具體判定)，脫色后對(duì)抗原熱修復(fù)25 min，將薄片置于3.0% H2O2室溫下孵育12 min，檸檬酸鈉伴高溫促進(jìn)抗原的修復(fù)，隨后冷卻10 min并清洗，使用小牛血封閉液封閉胃癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織20 min后清洗3次，每次2 min。隨后用兔抗人ZNF139單克隆抗體(美國(guó)Sigma公司提供)、鼠抗人VEGF 單克隆抗體(上海長(zhǎng)島抗體診斷試劑有限公司)；均按說(shuō)明書(shū)配比稀釋，稀釋后在4℃環(huán)境下孵化一夜。清洗后37℃環(huán)境下孵化二抗半小時(shí)。再用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物免疫組化劑孵育半小時(shí)，復(fù)溫50 min 后用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物免疫組化劑孵育0.5 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色10 min，蘇木素再染色5 min 后清洗、脫水、固定封片即可鏡下觀察。

1.3.2 染色觀察結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核在鏡下可見(jiàn)棕褐色顆粒物為ZNF139 和VEGF 表達(dá)陽(yáng)性表現(xiàn)，其中VEGF主要集中在細(xì)胞質(zhì)，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞占比和染色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)計(jì)分，最后綜合判定表達(dá)是否是陽(yáng)性。ZNF139 和VEGF 染色強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)色、淡黃、棕黃、棕褐依次對(duì)應(yīng)0 分、1 分、2 分、3 分。ZNF139表達(dá)陽(yáng)性顯色細(xì)胞所占比例計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：≤15%、15%～55%、55%～75%、>75%依次記為1 分、2 分、3 分、4 分。VEGF 表達(dá)陽(yáng)性顯色細(xì)胞所占比例計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：<10%、10%～25%、26%～50%、>50%依次記為0 分、1分、2分、3分。ZNF139陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞占比和染色強(qiáng)度評(píng)分相加為1 分計(jì)為陰性，>1 分計(jì)為陽(yáng)性。VEGF 陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞占比和染色強(qiáng)度評(píng)分相乘，0分為陰性，≥1分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；兩變量不滿足直線相關(guān)性分析條件，采用Spesrman 相關(guān)性分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌原發(fā)灶和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中ZNF139和VEGF 表達(dá)率比較胃癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶ZNF139和VEGF表達(dá)率明顯高于其在原發(fā)灶表達(dá)率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1，其中ZNF139、VEGF免疫組化染色結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 ZNF139免疫組化染色(×400)

圖2 VEGF免疫組化染色(×400)

表1 胃癌原發(fā)灶和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中ZNF139 和VEGF 表達(dá)率比較[例(%)]

2.2 胃癌癌組織ZNF139表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系胃癌癌組織ZNF139 表達(dá)率與腫瘤分化度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 胃癌癌組織ZNF139表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n=78,例(%)]

2.3 胃癌癌組織VEGF 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系胃癌癌組織VEGF表達(dá)率與腫瘤分化度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 胃癌癌組織VEGF表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.4 胃癌癌組織ZNF139與VEGF的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性胃癌癌組織ZNF139 與VEGF 的表達(dá)水平與腫瘤低分化、TNM 高分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 胃癌癌組織ZNF139與VEGF的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，胃癌發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中排名中均靠前，嚴(yán)重威脅人類生命健康和生活治療[11]。在胃癌發(fā)生和進(jìn)展中，腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡抵抗和凋亡調(diào)控逃逸，這促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性增殖、轉(zhuǎn)移，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞迅速蔓延[12]。此外，腫瘤局部豐富新生血對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、脫落和轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，嚴(yán)重影響化療效果。故促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制血管生成對(duì)抑制胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、改善患者預(yù)后意義重大[13-14]。既往研究中指出ZNF139 參與腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控和增殖信號(hào)通路調(diào)控、VEGF 抑制劑一直作為惡性腫瘤患者抗血管生成化療方案的主要用藥[15-16]。兩者與胃癌發(fā)生關(guān)系密切，但有關(guān)兩者在胃癌原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶間表達(dá)情況差異研究較少，故研究?jī)烧弑磉_(dá)情況與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生關(guān)系對(duì)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生患者治療藥物研發(fā)有一定啟發(fā)。

本研究結(jié)果顯示，胃癌患者原發(fā)灶中ZNF139、VEGF表達(dá)陽(yáng)性率低于區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。YAO等[17]在研究中指出ZNF139 與其對(duì)應(yīng)環(huán)狀RNA 可參與激活PI3K/AKT信號(hào)通路，AKT屬于原癌基因，經(jīng)過(guò)磷酸化激活后可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移和分化；李勇等[18]在研究中指出ZNF139可通過(guò)促進(jìn)凋亡抑制蛋白表達(dá)來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡通路、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，故淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多屬于胃癌進(jìn)展期，其病變程度較原發(fā)灶重，腫瘤細(xì)胞增殖分化程度和凋亡逃避能力較高，故ZNF139表達(dá)程度高。VEGF促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖進(jìn)而產(chǎn)生豐富新生血管滿足腫瘤細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需求、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移、增加腫瘤細(xì)胞侵襲力[19-20]。故淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶多出現(xiàn)于胃癌中晚期，局部血管較原發(fā)灶豐富，VEGF 表達(dá)率較高，與修麗娟等[21]研究結(jié)果相似。

本研究結(jié)果顯示，胃癌患者原發(fā)灶中ZNF139、VEGF表達(dá)陽(yáng)性率與腫瘤分化程度、TNM分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系，這與李勇等[18]和王文廉等[22]結(jié)果相似，分析其原因可能是ZNF139高表達(dá)通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡基因Survivin、Bcl-2 來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡；通過(guò)激活原癌基因AKT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移，細(xì)胞形態(tài)與正常細(xì)胞差異大，故ZNF139 表達(dá)率與胃癌腫瘤低分化、TNM 高分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率呈正相關(guān)。VEGF 可與相應(yīng)受體結(jié)合激活下游信號(hào)通路、靶向作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞、破壞血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性來(lái)促進(jìn)血管新生進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖分化[23-24]。此外，VEGF種類較多，其中VEGF-C 過(guò)表達(dá)可促進(jìn)淋巴管生成進(jìn)而誘發(fā)腫瘤細(xì)胞通過(guò)淋巴管發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切，故VEGF 表達(dá)率與胃癌腫瘤低分化、TNM高分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生呈正相關(guān)。

綜上所述，胃癌發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后ZNF139、VEGF 表達(dá)能力增強(qiáng)，兩者表達(dá)情況與胃癌病情進(jìn)展密切相關(guān)。