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        免疫親和柱凈化-HPLC光化學(xué)柱后衍生法測定玉米中黃曲霉毒素B1的含量

        2021-10-14 02:25:40尹安胤
        現(xiàn)代食品 2021年15期
        關(guān)鍵詞:標(biāo)準(zhǔn)檢測

        ◎ 尹安胤

        (云南省德宏州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心,云南 德宏 678400)

        黃曲霉毒素(Aflatoxin,AF)是黃曲霉和寄生曲霉的次級代謝產(chǎn)物,種類繁多,常見的有黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2,其中以黃曲霉毒素B1(AFB1)分布最廣、毒性最強(qiáng)、危害最大。AFB1主要污染糧油類食品,如花生、玉米、大米等,其中以花生和玉米污染最為嚴(yán)重[1]。1993年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將AFB1定為I類致癌物,AFB1是目前最強(qiáng)的致癌化學(xué)物質(zhì)之一,人體長期攝入含AFB1的食品會誘導(dǎo)肝癌等多種癌癥的產(chǎn)生,對健康造成巨大威脅,在歷年的《國家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則》中都將其列為重點(diǎn)檢測項(xiàng)目。

        在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)中規(guī)定了玉米及其制品中AFB1的限量值為20 μg·kg-1[2]。目前我國對食品中AFB1的檢測主要以《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》(GB 5009.22—2016)的規(guī)定為主[3],標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了AFB1檢測的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜(柱前、柱后衍生)法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法和薄層色譜法。其中,薄層色譜法操作復(fù)雜、步驟煩瑣、靈敏度低,屬于半定量方法,且試劑消耗較大,會對檢測人員身體健康造成較大危害[4];酶聯(lián)免疫吸附篩查法實(shí)驗(yàn)影響因素較多,容易出現(xiàn)假陽性,可靠性較差,無法實(shí)現(xiàn)精確定量,主要用于大批量樣品的篩查;液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法雖然檢測靈敏度在幾種方法中最高,但設(shè)備昂貴、檢測和維護(hù)成本高且對檢測人員要求較高,在基層實(shí)驗(yàn)室很難得到應(yīng)用;高效液相色譜法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡單、檢測和維護(hù)成本較低等優(yōu)點(diǎn),因此仍為目前AFB1檢測的首選方法。本文采用免疫親和柱凈化-HPLC光化學(xué)柱后衍生法建立一種快速、準(zhǔn)確檢測玉米中AFB1的方法。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        高效液相色譜儀-熒光檢測器,島津LC-20A、RF-20A;光化學(xué)衍生器,北京華安麥科生物科技有限公司;水浴恒溫振蕩器,常州國華電器有限公司;BS1254電子天平,德國賽多利斯股份有限公司;Maxi Mix Ⅱ渦旋振蕩器,賽默飛世爾科技有限公司;超純水機(jī),密理博中國有限公司;0.22 μm針式濾膜,天津津騰實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;玻璃纖維濾紙(WHATMAN 1827-110),上海根生生物科技有限公司;甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純),默克化工技術(shù)(上海)有限公司;AFB1免疫親和柱(3 mL),北京華安麥科生物科技有限公司;甲醇中 AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg·mL-1),默克 Supelco。

        1.2 實(shí)驗(yàn)樣品

        玉米粉中黃曲霉毒素B1質(zhì)控樣品,購自壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

        1.3 色譜條件

        色 譜 柱:Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:甲醇∶水(45∶55);進(jìn)樣量:10 μL;熒光檢測器激發(fā)波長:360 nm,發(fā)射波長:450 nm。

        1.4 提取與凈化

        準(zhǔn)確稱取10 g(精確到0.01 g)混合均勻的樣品于250 mL具塞碘量瓶中,加入2 g氯化鈉與100 mL提取液(70%甲醇-水溶液)混勻,置于搖床上以200 r·min-1劇烈振蕩20 min,用快速定性濾紙過濾并收集濾液,取10 mL濾液于小燒杯中并加入10 mL去離子水稀釋,再用玻璃纖維濾紙過濾,并收集濾液作為待凈化液。

        取出免疫親和柱并使其恢復(fù)至室溫,連接10 mL注射器筒并固定在氣控操作架上,取10 mL待凈化液注入注射器筒中,去掉親和柱下方堵頭,調(diào)節(jié)氣流,使液體以1~2滴/s的速度流出,待液體排干后,用10 mL去離子水以2~3滴/s的流速洗滌2次,待液體排干后,用氣流吹去殘留液滴,加入1 mL甲醇以1滴/s的流速洗脫,收集洗脫液于10 mL刻度離心管中并定容至1 mL。洗脫液用0.22 μm針式濾膜過濾至色譜進(jìn)樣小瓶中供液相色譜測定,與標(biāo)準(zhǔn)系列比較,外標(biāo)法定量。

        1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        準(zhǔn)確吸取 AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg·mL-1)0.1 mL 于25 mL棕色容量瓶中并用乙腈定容,配制成80.0 ng·mL-1的中間液,再用乙腈稀釋得到 2.5 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL、40.0 ng·mL-1和 80.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。將工作溶液注入液相色譜中,按照1.3中的色譜條件進(jìn)行測定,以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的濃度為縱坐標(biāo),峰面積為橫坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。AFB1的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1,標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。試樣中AFB1含量按公式(1)和(2)計(jì)算:

        圖1 AFB1標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

        圖2 AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

        式中,X-試樣中AFB1的含量,μg·kg-1;m-稱取試樣質(zhì)量,g;c-進(jìn)樣溶液中AFB1在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的濃度,ng·mL-1;V-樣品經(jīng)免疫親和柱凈化洗脫后的最終定容體積,mL;f—稀釋倍數(shù);V1-加入的提取液體積,mL;V2-稀釋用樣品濾液的體積,mL;V3-加入稀釋液的體積,mL;V4-注入免疫親和柱的待凈化液體積,mL。

        本實(shí)驗(yàn)中稀釋倍數(shù)f=20,保留時(shí)間為16.7 min,經(jīng)計(jì)算得試樣中 AFB1含量為 17.2 μg·kg-1。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 免疫親和柱的應(yīng)用

        本文采用免疫親和柱進(jìn)行凈化處理。AFB1免疫親和柱的原理是抗原抗體反應(yīng),抗體連接在柱體內(nèi),樣品中的AFB1經(jīng)過提取、過濾、稀釋后緩慢通過AFB1免疫親和柱,在免疫親和柱內(nèi)AFB1與抗體結(jié)合,之后洗滌免疫親和柱除去沒有被結(jié)合的其他雜質(zhì)。最后用甲醇洗脫AFB1供液相色譜上機(jī)檢測。免疫親和柱可選擇性地吸附樣品提取溶液中的AFB1,從而對樣品提取溶液起到針對性的純化作用[5]。免疫親和柱凈化法樣品色譜圖雜峰較少、峰型對稱、基線平穩(wěn)(圖3),回收率高,樣品凈化過程操作較為簡單快速,可有效提高檢測方法的靈敏度和準(zhǔn)確度。

        圖3 免疫親和柱凈化后樣品色譜圖

        2.2 光化學(xué)柱后衍生的效果

        由于AFB1在水溶液中會發(fā)生熒光淬滅,在進(jìn)行高效液相色譜法測定前要進(jìn)行衍生化處理[6]。在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》(GB 5009.22—2016)中規(guī)定了柱前衍生和柱后衍生兩種衍生方法。柱前衍生法操作過程煩瑣,衍生化過程中易引入雜質(zhì)和干擾峰,可能造成目標(biāo)化合物的損失。本文采用柱后光化學(xué)衍生法,該法操作簡單,設(shè)備成本低,只需在柱后連接光化學(xué)衍生器,通過紫外光照射可使樣品溶液中的AFB1熒光特性顯著增強(qiáng),從而有效提高方法的靈敏度。

        2.3 線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限

        本實(shí)驗(yàn)中AFB1濃度在2.5~80.0 ng·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=2.08×10-5X+0.411,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。隨試樣同時(shí)做空白試驗(yàn),以3倍信噪比計(jì)算出檢出限為0.05 μg·kg-1。

        2.4 精密度與回收率實(shí)驗(yàn)

        選取一個(gè)加標(biāo)樣品按照免疫親和柱凈化法處理后重復(fù)測定6次,根據(jù)AFB1峰面積計(jì)算出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1。從由表1數(shù)據(jù)可知,RSD為2.17%,表明該方法精密度良好。

        表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果表

        用已知AFB1含量的玉米粉樣品制備3個(gè)添加水平的加標(biāo)樣品:5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-1,每個(gè)水平制備6個(gè)平行樣,按照免疫親和柱凈化法處理后上機(jī)測定,分別計(jì)算回收率和RSD,結(jié)果見表2。從表2數(shù)據(jù)可知,3個(gè)添加水平下的平均回收率為88.5%~94.3%,RSD為1.96%~2.57%,表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

        表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果表

        3 結(jié)論

        本文建立了玉米中AFB1的免疫親和柱凈化-HPLC光化學(xué)柱后衍生測定方法,免疫親和柱能選擇性地識別和富集AFB1,光化學(xué)柱后衍生能夠顯著增強(qiáng)AFB1的熒光特性,可有效提高靈敏度,樣品加標(biāo)回收率為88.5%~94.3%。該方法具有操作簡便、快速、穩(wěn)定性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn),能夠滿足玉米及其制品中AFB1含量的快速測定需求。

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