◎ 荊輝華，向 俊，陳同強，李 宏，鄒子爵，王亮亮

（1.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410000；2.食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410000）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是一種常見的真菌毒素，具有較強的細(xì)胞毒性，攝入后易引起急、慢性中毒，表現(xiàn)為惡心、嘔吐及中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等，所以又名嘔吐毒素，是由禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌和雪腐鐮刀菌等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1-4]。DON作為全球污染較高的真菌毒素之一，主要存在于小麥、大麥、燕麥、玉米等糧食作物中[5-7]。目前，主要國家和地區(qū)都制定了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量標(biāo)準(zhǔn)[8-9]。DON在我國糧食中檢出非常普遍[10-13]。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中規(guī)定谷物及其制品的限量為1 000 μg·kg-1，具體類別包括玉米、玉米面（渣、片）、小麥、大麥、麥片及小麥粉[14]。谷物及其制品作為人們最重要的糧食來源，其質(zhì)量應(yīng)得到有效控制及保障。準(zhǔn)確檢測是質(zhì)量控制的重要前提，檢驗機構(gòu)應(yīng)發(fā)揮自身的優(yōu)勢，為我國真菌毒素污染水平的客觀評價及相應(yīng)管控措施的實施提供可靠的技術(shù)支撐。檢驗機構(gòu)還應(yīng)不斷提高檢測能力和水平，更好地發(fā)揮檢驗檢測對高質(zhì)量發(fā)展的技術(shù)指導(dǎo)作用，提高產(chǎn)品質(zhì)量，保障食品安全。

盲樣考核是評估和提高檢驗實驗室檢測技術(shù)水平的重要手段，是實驗室質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)，可直接、客觀地反映實驗室的檢測能力，也是國家市場監(jiān)管總局為保障產(chǎn)品質(zhì)量，考核并提升相關(guān)檢驗檢測機構(gòu)技術(shù)能力的重要手段。林芳等[15]對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇能力驗證結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，其重點是分析樣品的均勻穩(wěn)定性和結(jié)果統(tǒng)計的科學(xué)性，本文重點從檢測的角度，分析檢測過程中的注意事項及檢測關(guān)鍵點，提高實驗室真菌毒素的檢測能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檢測的樣品為陳糧，由中國食品藥品檢定研究院提供，共5瓶，編號分別為A、B、C、D、E，每瓶約60 g。質(zhì)控樣品（基質(zhì)為玉米），DON免疫親和柱。DON標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 mg·L-1），O2Si，乙腈、甲醇、乙酸銨（色譜純，上海安譜），水為Millipore凈化的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Agilent1260 Infinity高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；SCIEX QTrap 4500液質(zhì)聯(lián)用儀（美國AB公司）；Milli-Q Reference mili-Q advanced A10超純水儀（美國Millipore公司）；CM-1000高速振蕩器（東京理化器械株式會社）；BSA224s電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Multifuge X1R高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3 樣品前處理方法

1.3.1 HPLC法前處理

稱取5 g樣品，定量加純水25.0 mL，渦旋振蕩20 min，超聲提取 5 min，8 000 r·min-1離心 5 min，取上清液，待凈化。將DON免疫親和柱放置至室溫，置于高通量固相萃取儀上，待免疫親和柱中原有液體流出后，準(zhǔn)確移取2.0 mL濾液于免疫親和柱中，控制流速1 滴/s的速度通過免疫親和柱。用5 mL磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate Buffered Solution，PBS）和5 mL去離子水先后淋洗免疫親和柱。直至空氣進(jìn)入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱。加入2 mL甲醇洗脫，流速控制在1 滴/s，收集洗脫液于10 mL離心管中，40 ℃氮氣吹至近干，用1.0 mL初始流動相渦旋溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，待高效液相色譜儀測定。

1.3.2 HPLC-MS法前處理

稱取2 g試樣于50 mL離心管中，加20.0 mL乙腈-水溶液（84∶16，V/V），渦旋振蕩20 min，超聲5 min，8 000 r·min-1離心5 min，收集上清液。準(zhǔn)確移取5.0 mL上清液置于10 mL離心管中，于40～50 ℃氮氣吹干，加入2 mL水充分溶解殘渣，過免疫親和柱，步驟同HPLC。加入1.0 mL20%甲醇，渦旋30 s溶解殘留物，0.22 μm濾膜過濾，待液質(zhì)聯(lián)用檢測。

1.3.3 色譜條件

（1）HPLC方法條件。色譜柱：Agilent C18柱，規(guī)格為4.6 mm×150 mm；進(jìn)樣量50 μL；柱溫35 ℃；流動相：甲醇+水（20+80），流速0.8 mL·min-1；等度洗脫，檢測波長218 nm。

（2）HPLC-MS方法條件。色譜柱：Thermo Hypersil GOLD柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；進(jìn)樣量5 μL；柱溫35 ℃；流動相：A相為乙腈，B相為5 mmol·L-1乙酸銨溶液，流速0.2 mL·min-1；梯度洗脫：20%A（0～ 1.0 min），90%A（4.0～ 7.5 min），20%A（7.6～12.0 min）。離子源模式：ESI-，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），毛細(xì)管電壓：4 500 V，離子源溫度500 ℃，噴霧器：40 psi，輔助氣：50 psi，碰撞氣：30 psi。其余參數(shù)見表1。

表1 DON的定量、定性離子對及質(zhì)譜分析參數(shù)表

1.3.4 主要影響因素考察及內(nèi)部質(zhì)量控制

主要因素試驗考察包含上機溶劑選擇、標(biāo)準(zhǔn)品量值核查、免疫親和柱驗收；質(zhì)量控制試驗包含預(yù)實驗、樣品均勻性試驗、方法比對、儀器比對、人員比對、重復(fù)性試驗和質(zhì)控樣測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗中主要的影響因素考察

2.1.1 樣品復(fù)溶溶劑的選擇

由圖1可知，HPLC法檢測選用甲醇、初始流動相甲醇/水（20/80）作為樣品的上機溶劑，發(fā)現(xiàn)采用純甲醇溶解目標(biāo)物峰嚴(yán)重的展寬，采用流動相溶解的DON峰型較好。由圖2可知，在HPLC-MS檢測中，純甲醇配制的目標(biāo)物峰嚴(yán)重展寬，信號明顯降低，20%甲醇復(fù)溶樣品則峰型較好，響應(yīng)較高。表明DON存在較強的溶劑效應(yīng)。采用液相及液質(zhì)檢測真菌毒素時，通常存在溶劑效應(yīng)，如果直接采用洗脫溶劑上機，會造成目標(biāo)峰峰型差，嚴(yán)重影響定性及定量，檢測中應(yīng)注意將目標(biāo)物洗脫后進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換，選擇與初始流動相匹配的復(fù)溶溶劑。

圖1 DON的液相色譜圖（溶劑為甲醇和20%甲醇）

圖2 DON的液質(zhì)聯(lián)用離子色譜圖（溶劑為甲醇和20%甲醇）

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品量值核查

選用了實驗室現(xiàn)有的均在有效期內(nèi)的3種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對，來源均為O2Si，濃度為200 mg·L-1，標(biāo)準(zhǔn)品的溶劑為甲醇、乙腈及乙酸乙酯∶甲醇=95∶5，分別采用20%甲醇稀釋配制成濃度為200 ng·mL-1、500 ng·mL-1、1000 ng·mL-1的稀釋液，重復(fù)進(jìn)樣 2 次，比較同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。結(jié)果顯示不同標(biāo)準(zhǔn)品之間同一濃度的峰面積RSD均小于5%。甲醇、乙腈為溶劑的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖一致（圖3A）。但溶劑為乙酸乙酯∶甲醇=95∶5的標(biāo)準(zhǔn)品存在較大的干擾峰（圖3B），經(jīng)驗證為溶劑乙酸乙酯的峰（圖3C），檢驗中應(yīng)注意區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)品中目標(biāo)物及溶劑峰，防止錯認(rèn)。

圖3 不同標(biāo)準(zhǔn)品的DON色譜圖和乙酸乙酯色譜圖

在DAD檢測器中還可以利用光譜進(jìn)行區(qū)分，如圖4A所示，DON在波長218.5 nm處有較大吸收，光譜圖明顯區(qū)別于溶劑干擾峰圖4B。如果標(biāo)準(zhǔn)品中溶劑與配制的溶劑不互溶，配制時應(yīng)注意溶劑轉(zhuǎn)換。

圖4 DON的光譜（A）和干擾峰的光譜（B）圖

標(biāo)準(zhǔn)品量值準(zhǔn)確是確保準(zhǔn)確檢測的前提，鑒于現(xiàn)在市場上所供應(yīng)的商品化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、含量可能存在一定的差異性，直接影響到微量檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前，一些國標(biāo)增加了實用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度的校正方法，如在GB 5009.22—2016中，黃曲霉毒素B族和G族檢測中增加了標(biāo)準(zhǔn)液濃度的校正方法，沒有標(biāo)準(zhǔn)溶液的校正方法時，可采用不同廠家的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對、質(zhì)控樣測定等方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的量值核查，確保量值準(zhǔn)確。

2.1.3 前處理器皿污染干擾

前處理過程應(yīng)注意設(shè)備及器皿的潔凈度，DON前處理采用免疫親和柱凈化效果好，HPLC圖譜中基本無干擾，但試驗中發(fā)現(xiàn)全自動氮吹儀的氮吹管中有污染物殘留，會導(dǎo)致液相色圖譜上目標(biāo)物的位置有雜鋒干擾，嚴(yán)重影響定性及定量?？赡苡捎贒ON檢測波長較短，許多組分在該波長下都有吸收。試驗中應(yīng)注意用完及時清洗，保持氮吹管潔凈干燥，不直接接觸溶液，緩慢調(diào)節(jié)氣流，防止液體飛濺，以免造成目標(biāo)組分的污染及損失。

2.1.4 免疫親和柱驗收

免疫親和柱驗收包含了柱容量、回收率的驗收，GB 5009.111—2016[16]要求DON柱容量≥1 000 ng，回收率≥80%。試驗中使用了兩款不同的免疫親和柱，采用HPLC法進(jìn)行驗收時，結(jié)果顯示免疫親和柱A結(jié)果普遍高出免疫親和柱B結(jié)果，且部分回收率超出120%，經(jīng)空白試驗驗證免疫親和柱A存在本底值，且經(jīng)HPLC-MS測定該批次免疫親和柱本底值絕對含量達(dá)100～200 ng，因存在稀釋因子，該影響在計算后導(dǎo)致最終結(jié)果差別較大。

試劑耗材驗收也是確保結(jié)果準(zhǔn)確的前提，每批免疫親和柱使用前應(yīng)進(jìn)行驗收，除柱容量及回收率滿足檢測要求外，還要注意本底殘留。在實際檢測中，如發(fā)現(xiàn)有含量較高的樣品，還應(yīng)考慮免疫親和柱過載問題，若可能過載，則需減少移液體積或稀釋后移取部分液體，重新凈化，以得到準(zhǔn)確含量。

2.2 預(yù)試驗

正式檢測前，先對盲樣進(jìn)行預(yù)試驗測定，采用HPLC法，取樣量2 g，提取溶劑按比例減少，上柱液體積為2.0 mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為100～1 000 ng·mL-1。預(yù)試驗測得的樣品濃度為171～841 ng·mL-1，濃度處于線性范圍內(nèi)，計算樣品含量為400～2 000 μg·kg-1，上機濃度顯示免疫親和柱未過載。對于低含量的樣品可適當(dāng)增加過柱體積，增加儀器響應(yīng)以降低測定的誤差。

預(yù)試驗是盲樣考核中非常重要的環(huán)節(jié)，根據(jù)預(yù)試驗中獲得樣品中檢測組分的大致含量，可確定適宜的取樣量、前處理上柱體積、定容體積、加標(biāo)范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制范圍及合適的質(zhì)控樣品，并明確樣品是否需要濃縮或稀釋后進(jìn)行測定。

2.3 樣品均勻性試驗

樣品均勻是保障試驗結(jié)果準(zhǔn)確及其他質(zhì)控措施有效的重要前提，因獲得的盲樣樣品粒度大小存在差異，首先對樣品的均勻性進(jìn)行考察，采用HPLC法檢測，分別取10 g樣品，提取溶劑50 mL和取5 g樣品，提取溶劑為25 mL進(jìn)行比對，平行測定2次，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，取樣量為10 g和5 g的測定結(jié)果差異較小，RSD在0.46%～2.49%，含量低的樣品RSD差異稍大，表明樣品的均勻性良好。

表2 樣品均勻性測定表

2.4 方法比對

采用HPLC法及HPLC-MS法進(jìn)行比對試驗，平行測定2次，結(jié)果見表3。由表3可知，5組樣品HPLC法測定的樣品含量結(jié)果為471.0～1 850 μg·kg-1，HPLC-MS法檢測結(jié)果高于HPLC，其樣品含量為513.7～2 013μg·kg-1，且每組樣品的RSD較HPLC大。為探究HPLC-MS方法結(jié)果普遍高于HPLC的原因，兩者提取溶劑不同，檢測器不同，將液相法前處理樣品用液質(zhì)檢測，發(fā)現(xiàn)同一樣品液的HPLC-MS結(jié)果高于HPLC法，表明結(jié)果差異主要來源于儀器，而非前處理過程。同時，也表明兩種前處理方式對DON的提取較完全。該結(jié)果與姚霞等[17]采用玉米基質(zhì)進(jìn)行方法比對所得結(jié)果類似，即HPLC-MS法所測得結(jié)果高于HPLC法，可能在HPLC-MS法檢測中，存在基質(zhì)增強效應(yīng)。因未找到空白的盲樣基質(zhì)，未做基質(zhì)加標(biāo)曲線驗證，但基質(zhì)效應(yīng)在HPLC-MS檢測中非常常見，一般表現(xiàn)為基質(zhì)增強或基質(zhì)減弱[18-19]，樣品經(jīng)過凈化后仍然可能存在糖類、肽類有機化合物、無機鹽雜質(zhì)等物質(zhì)干擾目標(biāo)物電離，影響離子化效率，采用空白樣品基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線可降低基質(zhì)干擾。HPLC-MS法靈敏度高，抗干擾能力好，穩(wěn)定性要低于HPLC法，但檢測中應(yīng)注意基質(zhì)效應(yīng)影響。

表3 不同檢測方法結(jié)果比較表

2.5 儀器比對

試驗中用Waters和Agilent液相色譜儀比對測定DON，儀器比對采用同一前處理樣品在不同儀器進(jìn)樣，結(jié)果顯示，RSD檢測結(jié)果均小于5%，差異性小，且都能滿足定性定量要求，但DON在不同儀器上的響應(yīng)稍有差別，這可能與不同儀器中檢測器的設(shè)置有關(guān)，Waters以AU為單位，Agilent以mAU為單位，同一濃度水平的DON，Agilent中的圖譜信號稍高，基線平穩(wěn)，儀器噪音小，更易直觀地判斷目標(biāo)物，如圖5、圖6所示。實驗室可根據(jù)實際情況結(jié)合儀器對目標(biāo)物的響應(yīng)加以選擇。但無論采用哪種儀器，確?；€穩(wěn)定，柱效分離度及峰型良好，儀器靈敏度滿足要求。

圖5 DON的（Agilent）液相色譜圖

圖6 DON的（Waters）液相色譜圖

2.6 人員比對

人員比對采用HPLC法在同一臺儀器進(jìn)行，每組樣品平行測定2次，所得結(jié)果見表4。結(jié)果顯示人員比對的同組樣品的RSD在1.99%～5.69%，對于含量較高的樣品，測定差值較小。不同檢測人員因檢驗習(xí)慣、規(guī)范程度，對檢測方法理解及操作要領(lǐng)掌握的不同，可能會帶來結(jié)果的差別。重要考核中人員比對試驗可安排具備豐富經(jīng)驗和良好技術(shù)水平的不同人員進(jìn)行，不同人員對結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)可增加結(jié)果的可信度，人員比對可作為日常檢驗活動中質(zhì)量控制的一種重要手段。

表4 人員比對結(jié)果表

2.7 加標(biāo)試驗

本次試驗用陳糧，因樣品的量有限，且真菌毒素在樣品中分布可能存在不均情況，試驗中采用同一樣品的提取液加標(biāo)，選用含量較低D樣品的提取液加標(biāo)，添加3水平，平行測定2次，結(jié)果見表5。由表5可知，HPLC法的回收率在92.4%～103%，HPLC-MS法的回收率在99.2%～119%，HPLC-MS法回收率高于HPLC法。標(biāo)準(zhǔn)加入的目標(biāo)物其與樣品的結(jié)合作用異于樣品本身所含有的，并不能真實反映樣品的提取環(huán)節(jié)，但為減少誤差，試驗中宜采用相同基質(zhì)加標(biāo)；沒有相同基質(zhì)情況下，可采用近似樣品基質(zhì)，加標(biāo)后注意放置一段時間，讓標(biāo)準(zhǔn)品與樣品充分混合作用，標(biāo)準(zhǔn)加入量應(yīng)接近樣品的真實含量，但應(yīng)注意不超過免疫親和柱的柱容量。

表5 加標(biāo)試驗結(jié)果表

2.8 質(zhì)控樣的測定

試驗中選取了兩種質(zhì)控樣，質(zhì)控樣A為新采購的樣品，質(zhì)控樣B為已開封半年，并按條件保存的樣品，基質(zhì)均為玉米。結(jié)果見表6。由表6可知，A的測定值在參考值范圍內(nèi)，B則低于參考值范圍，參照GB/T 27404—2008要求[20]，真值含量在0.010～10 mg·kg-1，偏差范圍為-20%～+10%，質(zhì)控樣B不滿足要求，這可能為質(zhì)控樣B已開封半年，且經(jīng)多次使用，導(dǎo)致樣品因吸潮或在不確定的溫度條件下真菌毒素含量發(fā)生了變化。因此，質(zhì)控樣應(yīng)選擇與樣品相同或相近的基質(zhì)，結(jié)果分析時，應(yīng)首先確保質(zhì)控樣是按規(guī)定的條件保存，后續(xù)使用應(yīng)注意監(jiān)測其含量變化。

表6 質(zhì)控樣測定結(jié)果表

2.9 結(jié)果報送

因HPLC-MS檢測結(jié)果偏高，試驗中未找到相似空白基質(zhì)曲線進(jìn)行校正，本次考核重點參考HPLC的檢測結(jié)果，充分考慮樣品均勻性測定、人員比對、儀器比對的試驗結(jié)果，采用多次測定的平均值報送。

3 結(jié)論

本次盲樣考核獲得滿意結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)品核查、試劑耗材驗收是確保結(jié)果準(zhǔn)確的重要前提，加標(biāo)試驗可評估方法及操作的有效性，采用合理的質(zhì)控樣測定是評估結(jié)果準(zhǔn)確性的有效手段。人員比對、儀器比對可進(jìn)一步增加結(jié)果的可靠性。實驗室應(yīng)根據(jù)自身條件選擇合適的方法、儀器，準(zhǔn)確把握前處理中的關(guān)鍵點，采用多種質(zhì)控方式相結(jié)合，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

盲樣考核能有效反應(yīng)實驗室的技術(shù)水平，本實驗室以盲樣考核為有效質(zhì)控手段，總結(jié)經(jīng)驗，明確試驗操作中的關(guān)鍵點，確保了盲樣考核結(jié)果的有效性和可靠性，實驗室編寫了該檢驗項目的操作要領(lǐng)及關(guān)鍵點，本實驗室在后續(xù)的DON能力驗證、赭曲霉毒素A國際能力驗證等真菌毒素考核中都取得滿意結(jié)果。同時，本文中所總結(jié)的經(jīng)驗及DON檢測關(guān)鍵點，同樣適用于其他真菌毒素的測定。