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        基于陳糧中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇盲樣考核的檢測關(guān)鍵點分析

        2021-10-14 02:25:36荊輝華陳同強鄒子爵王亮亮
        現(xiàn)代食品 2021年15期
        關(guān)鍵詞:標(biāo)準(zhǔn)檢測

        ◎ 荊輝華,向 俊,陳同強,李 宏,鄒子爵,王亮亮

        (1.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院,湖南 長沙 410000;2.食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點實驗室,湖南 長沙 410000)

        脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是一種常見的真菌毒素,具有較強的細(xì)胞毒性,攝入后易引起急、慢性中毒,表現(xiàn)為惡心、嘔吐及中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等,所以又名嘔吐毒素,是由禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌和雪腐鐮刀菌等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1-4]。DON作為全球污染較高的真菌毒素之一,主要存在于小麥、大麥、燕麥、玉米等糧食作物中[5-7]。目前,主要國家和地區(qū)都制定了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量標(biāo)準(zhǔn)[8-9]。DON在我國糧食中檢出非常普遍[10-13]。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)中規(guī)定谷物及其制品的限量為1 000 μg·kg-1,具體類別包括玉米、玉米面(渣、片)、小麥、大麥、麥片及小麥粉[14]。谷物及其制品作為人們最重要的糧食來源,其質(zhì)量應(yīng)得到有效控制及保障。準(zhǔn)確檢測是質(zhì)量控制的重要前提,檢驗機構(gòu)應(yīng)發(fā)揮自身的優(yōu)勢,為我國真菌毒素污染水平的客觀評價及相應(yīng)管控措施的實施提供可靠的技術(shù)支撐。檢驗機構(gòu)還應(yīng)不斷提高檢測能力和水平,更好地發(fā)揮檢驗檢測對高質(zhì)量發(fā)展的技術(shù)指導(dǎo)作用,提高產(chǎn)品質(zhì)量,保障食品安全。

        盲樣考核是評估和提高檢驗實驗室檢測技術(shù)水平的重要手段,是實驗室質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié),可直接、客觀地反映實驗室的檢測能力,也是國家市場監(jiān)管總局為保障產(chǎn)品質(zhì)量,考核并提升相關(guān)檢驗檢測機構(gòu)技術(shù)能力的重要手段。林芳等[15]對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇能力驗證結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計,其重點是分析樣品的均勻穩(wěn)定性和結(jié)果統(tǒng)計的科學(xué)性,本文重點從檢測的角度,分析檢測過程中的注意事項及檢測關(guān)鍵點,提高實驗室真菌毒素的檢測能力。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        檢測的樣品為陳糧,由中國食品藥品檢定研究院提供,共5瓶,編號分別為A、B、C、D、E,每瓶約60 g。質(zhì)控樣品(基質(zhì)為玉米),DON免疫親和柱。DON標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 mg·L-1),O2Si,乙腈、甲醇、乙酸銨(色譜純,上海安譜),水為Millipore凈化的超純水。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Waters e2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司);Agilent1260 Infinity高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);SCIEX QTrap 4500液質(zhì)聯(lián)用儀(美國AB公司);Milli-Q Reference mili-Q advanced A10超純水儀(美國Millipore公司);CM-1000高速振蕩器(東京理化器械株式會社);BSA224s電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);Multifuge X1R高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司)。

        1.3 樣品前處理方法

        1.3.1 HPLC法前處理

        稱取5 g樣品,定量加純水25.0 mL,渦旋振蕩20 min,超聲提取 5 min,8 000 r·min-1離心 5 min,取上清液,待凈化。將DON免疫親和柱放置至室溫,置于高通量固相萃取儀上,待免疫親和柱中原有液體流出后,準(zhǔn)確移取2.0 mL濾液于免疫親和柱中,控制流速1 滴/s的速度通過免疫親和柱。用5 mL磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate Buffered Solution,PBS)和5 mL去離子水先后淋洗免疫親和柱。直至空氣進(jìn)入親和柱中,棄去全部流出液,抽干小柱。加入2 mL甲醇洗脫,流速控制在1 滴/s,收集洗脫液于10 mL離心管中,40 ℃氮氣吹至近干,用1.0 mL初始流動相渦旋溶解,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,待高效液相色譜儀測定。

        1.3.2 HPLC-MS法前處理

        稱取2 g試樣于50 mL離心管中,加20.0 mL乙腈-水溶液(84∶16,V/V),渦旋振蕩20 min,超聲5 min,8 000 r·min-1離心5 min,收集上清液。準(zhǔn)確移取5.0 mL上清液置于10 mL離心管中,于40~50 ℃氮氣吹干,加入2 mL水充分溶解殘渣,過免疫親和柱,步驟同HPLC。加入1.0 mL20%甲醇,渦旋30 s溶解殘留物,0.22 μm濾膜過濾,待液質(zhì)聯(lián)用檢測。

        1.3.3 色譜條件

        (1)HPLC方法條件。色譜柱:Agilent C18柱,規(guī)格為4.6 mm×150 mm;進(jìn)樣量50 μL;柱溫35 ℃;流動相:甲醇+水(20+80),流速0.8 mL·min-1;等度洗脫,檢測波長218 nm。

        (2)HPLC-MS方法條件。色譜柱:Thermo Hypersil GOLD柱(100 mm×2.1 mm,3 μm);進(jìn)樣量5 μL;柱溫35 ℃;流動相:A相為乙腈,B相為5 mmol·L-1乙酸銨溶液,流速0.2 mL·min-1;梯度洗脫:20%A(0~ 1.0 min),90%A(4.0~ 7.5 min),20%A(7.6~12.0 min)。離子源模式:ESI-,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM),毛細(xì)管電壓:4 500 V,離子源溫度500 ℃,噴霧器:40 psi,輔助氣:50 psi,碰撞氣:30 psi。其余參數(shù)見表1。

        表1 DON的定量、定性離子對及質(zhì)譜分析參數(shù)表

        1.3.4 主要影響因素考察及內(nèi)部質(zhì)量控制

        主要因素試驗考察包含上機溶劑選擇、標(biāo)準(zhǔn)品量值核查、免疫親和柱驗收;質(zhì)量控制試驗包含預(yù)實驗、樣品均勻性試驗、方法比對、儀器比對、人員比對、重復(fù)性試驗和質(zhì)控樣測定。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 試驗中主要的影響因素考察

        2.1.1 樣品復(fù)溶溶劑的選擇

        由圖1可知,HPLC法檢測選用甲醇、初始流動相甲醇/水(20/80)作為樣品的上機溶劑,發(fā)現(xiàn)采用純甲醇溶解目標(biāo)物峰嚴(yán)重的展寬,采用流動相溶解的DON峰型較好。由圖2可知,在HPLC-MS檢測中,純甲醇配制的目標(biāo)物峰嚴(yán)重展寬,信號明顯降低,20%甲醇復(fù)溶樣品則峰型較好,響應(yīng)較高。表明DON存在較強的溶劑效應(yīng)。采用液相及液質(zhì)檢測真菌毒素時,通常存在溶劑效應(yīng),如果直接采用洗脫溶劑上機,會造成目標(biāo)峰峰型差,嚴(yán)重影響定性及定量,檢測中應(yīng)注意將目標(biāo)物洗脫后進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換,選擇與初始流動相匹配的復(fù)溶溶劑。

        圖1 DON的液相色譜圖(溶劑為甲醇和20%甲醇)

        圖2 DON的液質(zhì)聯(lián)用離子色譜圖(溶劑為甲醇和20%甲醇)

        2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品量值核查

        選用了實驗室現(xiàn)有的均在有效期內(nèi)的3種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對,來源均為O2Si,濃度為200 mg·L-1,標(biāo)準(zhǔn)品的溶劑為甲醇、乙腈及乙酸乙酯∶甲醇=95∶5,分別采用20%甲醇稀釋配制成濃度為200 ng·mL-1、500 ng·mL-1、1000 ng·mL-1的稀釋液,重復(fù)進(jìn)樣 2 次,比較同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。結(jié)果顯示不同標(biāo)準(zhǔn)品之間同一濃度的峰面積RSD均小于5%。甲醇、乙腈為溶劑的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖一致(圖3A)。但溶劑為乙酸乙酯∶甲醇=95∶5的標(biāo)準(zhǔn)品存在較大的干擾峰(圖3B),經(jīng)驗證為溶劑乙酸乙酯的峰(圖3C),檢驗中應(yīng)注意區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)品中目標(biāo)物及溶劑峰,防止錯認(rèn)。

        圖3 不同標(biāo)準(zhǔn)品的DON色譜圖和乙酸乙酯色譜圖

        在DAD檢測器中還可以利用光譜進(jìn)行區(qū)分,如圖4A所示,DON在波長218.5 nm處有較大吸收,光譜圖明顯區(qū)別于溶劑干擾峰圖4B。如果標(biāo)準(zhǔn)品中溶劑與配制的溶劑不互溶,配制時應(yīng)注意溶劑轉(zhuǎn)換。

        圖4 DON的光譜(A)和干擾峰的光譜(B)圖

        標(biāo)準(zhǔn)品量值準(zhǔn)確是確保準(zhǔn)確檢測的前提,鑒于現(xiàn)在市場上所供應(yīng)的商品化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、含量可能存在一定的差異性,直接影響到微量檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前,一些國標(biāo)增加了實用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度的校正方法,如在GB 5009.22—2016中,黃曲霉毒素B族和G族檢測中增加了標(biāo)準(zhǔn)液濃度的校正方法,沒有標(biāo)準(zhǔn)溶液的校正方法時,可采用不同廠家的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對、質(zhì)控樣測定等方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的量值核查,確保量值準(zhǔn)確。

        2.1.3 前處理器皿污染干擾

        前處理過程應(yīng)注意設(shè)備及器皿的潔凈度,DON前處理采用免疫親和柱凈化效果好,HPLC圖譜中基本無干擾,但試驗中發(fā)現(xiàn)全自動氮吹儀的氮吹管中有污染物殘留,會導(dǎo)致液相色圖譜上目標(biāo)物的位置有雜鋒干擾,嚴(yán)重影響定性及定量??赡苡捎贒ON檢測波長較短,許多組分在該波長下都有吸收。試驗中應(yīng)注意用完及時清洗,保持氮吹管潔凈干燥,不直接接觸溶液,緩慢調(diào)節(jié)氣流,防止液體飛濺,以免造成目標(biāo)組分的污染及損失。

        2.1.4 免疫親和柱驗收

        免疫親和柱驗收包含了柱容量、回收率的驗收,GB 5009.111—2016[16]要求DON柱容量≥1 000 ng,回收率≥80%。試驗中使用了兩款不同的免疫親和柱,采用HPLC法進(jìn)行驗收時,結(jié)果顯示免疫親和柱A結(jié)果普遍高出免疫親和柱B結(jié)果,且部分回收率超出120%,經(jīng)空白試驗驗證免疫親和柱A存在本底值,且經(jīng)HPLC-MS測定該批次免疫親和柱本底值絕對含量達(dá)100~200 ng,因存在稀釋因子,該影響在計算后導(dǎo)致最終結(jié)果差別較大。

        試劑耗材驗收也是確保結(jié)果準(zhǔn)確的前提,每批免疫親和柱使用前應(yīng)進(jìn)行驗收,除柱容量及回收率滿足檢測要求外,還要注意本底殘留。在實際檢測中,如發(fā)現(xiàn)有含量較高的樣品,還應(yīng)考慮免疫親和柱過載問題,若可能過載,則需減少移液體積或稀釋后移取部分液體,重新凈化,以得到準(zhǔn)確含量。

        2.2 預(yù)試驗

        正式檢測前,先對盲樣進(jìn)行預(yù)試驗測定,采用HPLC法,取樣量2 g,提取溶劑按比例減少,上柱液體積為2.0 mL,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為100~1 000 ng·mL-1。預(yù)試驗測得的樣品濃度為171~841 ng·mL-1,濃度處于線性范圍內(nèi),計算樣品含量為400~2 000 μg·kg-1,上機濃度顯示免疫親和柱未過載。對于低含量的樣品可適當(dāng)增加過柱體積,增加儀器響應(yīng)以降低測定的誤差。

        預(yù)試驗是盲樣考核中非常重要的環(huán)節(jié),根據(jù)預(yù)試驗中獲得樣品中檢測組分的大致含量,可確定適宜的取樣量、前處理上柱體積、定容體積、加標(biāo)范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制范圍及合適的質(zhì)控樣品,并明確樣品是否需要濃縮或稀釋后進(jìn)行測定。

        2.3 樣品均勻性試驗

        樣品均勻是保障試驗結(jié)果準(zhǔn)確及其他質(zhì)控措施有效的重要前提,因獲得的盲樣樣品粒度大小存在差異,首先對樣品的均勻性進(jìn)行考察,采用HPLC法檢測,分別取10 g樣品,提取溶劑50 mL和取5 g樣品,提取溶劑為25 mL進(jìn)行比對,平行測定2次,結(jié)果見表2。結(jié)果顯示,取樣量為10 g和5 g的測定結(jié)果差異較小,RSD在0.46%~2.49%,含量低的樣品RSD差異稍大,表明樣品的均勻性良好。

        表2 樣品均勻性測定表

        2.4 方法比對

        采用HPLC法及HPLC-MS法進(jìn)行比對試驗,平行測定2次,結(jié)果見表3。由表3可知,5組樣品HPLC法測定的樣品含量結(jié)果為471.0~1 850 μg·kg-1,HPLC-MS法檢測結(jié)果高于HPLC,其樣品含量為513.7~2 013μg·kg-1,且每組樣品的RSD較HPLC大。為探究HPLC-MS方法結(jié)果普遍高于HPLC的原因,兩者提取溶劑不同,檢測器不同,將液相法前處理樣品用液質(zhì)檢測,發(fā)現(xiàn)同一樣品液的HPLC-MS結(jié)果高于HPLC法,表明結(jié)果差異主要來源于儀器,而非前處理過程。同時,也表明兩種前處理方式對DON的提取較完全。該結(jié)果與姚霞等[17]采用玉米基質(zhì)進(jìn)行方法比對所得結(jié)果類似,即HPLC-MS法所測得結(jié)果高于HPLC法,可能在HPLC-MS法檢測中,存在基質(zhì)增強效應(yīng)。因未找到空白的盲樣基質(zhì),未做基質(zhì)加標(biāo)曲線驗證,但基質(zhì)效應(yīng)在HPLC-MS檢測中非常常見,一般表現(xiàn)為基質(zhì)增強或基質(zhì)減弱[18-19],樣品經(jīng)過凈化后仍然可能存在糖類、肽類有機化合物、無機鹽雜質(zhì)等物質(zhì)干擾目標(biāo)物電離,影響離子化效率,采用空白樣品基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線可降低基質(zhì)干擾。HPLC-MS法靈敏度高,抗干擾能力好,穩(wěn)定性要低于HPLC法,但檢測中應(yīng)注意基質(zhì)效應(yīng)影響。

        表3 不同檢測方法結(jié)果比較表

        2.5 儀器比對

        試驗中用Waters和Agilent液相色譜儀比對測定DON,儀器比對采用同一前處理樣品在不同儀器進(jìn)樣,結(jié)果顯示,RSD檢測結(jié)果均小于5%,差異性小,且都能滿足定性定量要求,但DON在不同儀器上的響應(yīng)稍有差別,這可能與不同儀器中檢測器的設(shè)置有關(guān),Waters以AU為單位,Agilent以mAU為單位,同一濃度水平的DON,Agilent中的圖譜信號稍高,基線平穩(wěn),儀器噪音小,更易直觀地判斷目標(biāo)物,如圖5、圖6所示。實驗室可根據(jù)實際情況結(jié)合儀器對目標(biāo)物的響應(yīng)加以選擇。但無論采用哪種儀器,確?;€穩(wěn)定,柱效分離度及峰型良好,儀器靈敏度滿足要求。

        圖5 DON的(Agilent)液相色譜圖

        圖6 DON的(Waters)液相色譜圖

        2.6 人員比對

        人員比對采用HPLC法在同一臺儀器進(jìn)行,每組樣品平行測定2次,所得結(jié)果見表4。結(jié)果顯示人員比對的同組樣品的RSD在1.99%~5.69%,對于含量較高的樣品,測定差值較小。不同檢測人員因檢驗習(xí)慣、規(guī)范程度,對檢測方法理解及操作要領(lǐng)掌握的不同,可能會帶來結(jié)果的差別。重要考核中人員比對試驗可安排具備豐富經(jīng)驗和良好技術(shù)水平的不同人員進(jìn)行,不同人員對結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)可增加結(jié)果的可信度,人員比對可作為日常檢驗活動中質(zhì)量控制的一種重要手段。

        表4 人員比對結(jié)果表

        2.7 加標(biāo)試驗

        本次試驗用陳糧,因樣品的量有限,且真菌毒素在樣品中分布可能存在不均情況,試驗中采用同一樣品的提取液加標(biāo),選用含量較低D樣品的提取液加標(biāo),添加3水平,平行測定2次,結(jié)果見表5。由表5可知,HPLC法的回收率在92.4%~103%,HPLC-MS法的回收率在99.2%~119%,HPLC-MS法回收率高于HPLC法。標(biāo)準(zhǔn)加入的目標(biāo)物其與樣品的結(jié)合作用異于樣品本身所含有的,并不能真實反映樣品的提取環(huán)節(jié),但為減少誤差,試驗中宜采用相同基質(zhì)加標(biāo);沒有相同基質(zhì)情況下,可采用近似樣品基質(zhì),加標(biāo)后注意放置一段時間,讓標(biāo)準(zhǔn)品與樣品充分混合作用,標(biāo)準(zhǔn)加入量應(yīng)接近樣品的真實含量,但應(yīng)注意不超過免疫親和柱的柱容量。

        表5 加標(biāo)試驗結(jié)果表

        2.8 質(zhì)控樣的測定

        試驗中選取了兩種質(zhì)控樣,質(zhì)控樣A為新采購的樣品,質(zhì)控樣B為已開封半年,并按條件保存的樣品,基質(zhì)均為玉米。結(jié)果見表6。由表6可知,A的測定值在參考值范圍內(nèi),B則低于參考值范圍,參照GB/T 27404—2008要求[20],真值含量在0.010~10 mg·kg-1,偏差范圍為-20%~+10%,質(zhì)控樣B不滿足要求,這可能為質(zhì)控樣B已開封半年,且經(jīng)多次使用,導(dǎo)致樣品因吸潮或在不確定的溫度條件下真菌毒素含量發(fā)生了變化。因此,質(zhì)控樣應(yīng)選擇與樣品相同或相近的基質(zhì),結(jié)果分析時,應(yīng)首先確保質(zhì)控樣是按規(guī)定的條件保存,后續(xù)使用應(yīng)注意監(jiān)測其含量變化。

        表6 質(zhì)控樣測定結(jié)果表

        2.9 結(jié)果報送

        因HPLC-MS檢測結(jié)果偏高,試驗中未找到相似空白基質(zhì)曲線進(jìn)行校正,本次考核重點參考HPLC的檢測結(jié)果,充分考慮樣品均勻性測定、人員比對、儀器比對的試驗結(jié)果,采用多次測定的平均值報送。

        3 結(jié)論

        本次盲樣考核獲得滿意結(jié)果,標(biāo)準(zhǔn)品核查、試劑耗材驗收是確保結(jié)果準(zhǔn)確的重要前提,加標(biāo)試驗可評估方法及操作的有效性,采用合理的質(zhì)控樣測定是評估結(jié)果準(zhǔn)確性的有效手段。人員比對、儀器比對可進(jìn)一步增加結(jié)果的可靠性。實驗室應(yīng)根據(jù)自身條件選擇合適的方法、儀器,準(zhǔn)確把握前處理中的關(guān)鍵點,采用多種質(zhì)控方式相結(jié)合,確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

        盲樣考核能有效反應(yīng)實驗室的技術(shù)水平,本實驗室以盲樣考核為有效質(zhì)控手段,總結(jié)經(jīng)驗,明確試驗操作中的關(guān)鍵點,確保了盲樣考核結(jié)果的有效性和可靠性,實驗室編寫了該檢驗項目的操作要領(lǐng)及關(guān)鍵點,本實驗室在后續(xù)的DON能力驗證、赭曲霉毒素A國際能力驗證等真菌毒素考核中都取得滿意結(jié)果。同時,本文中所總結(jié)的經(jīng)驗及DON檢測關(guān)鍵點,同樣適用于其他真菌毒素的測定。

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