◎ 賈永紅，廉立偉，劉小濤，周潤芝

（1.浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100；2.寧波市牛奶集團(tuán)有限公司，浙江 寧波 315033）

在生理條件下，線粒體在氧化磷酸化的過程中會產(chǎn)生少量的超氧陰離子、過氧化物、含氧自由基等分子，且生成量伴隨機(jī)體的日益衰老而逐漸增多。同時，外界環(huán)境中的光、射線、污染以及日常生活中不健康食品、不良生活習(xí)慣等因素也會導(dǎo)致這些活性氧分子的生成。雖說少量的活性氧對組織抗菌消炎具有積極作用，然而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在大量活性氧時，這些氧自由基會攻擊生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸和不飽和脂肪酸等，導(dǎo)致細(xì)胞或組織的氧化損傷甚至基因突變，破環(huán)機(jī)體內(nèi)原有的氧化還原平衡，導(dǎo)致動脈硬化、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等疾病[1-2]。因此，研發(fā)抗氧化分子來對抗過高含量的活性氧是維持體內(nèi)氧化還原過程平衡、降低疾病發(fā)生風(fēng)險的重要舉措?？寡趸肿涌蓙碓从谒?、蔬菜等天然食物，也可通過化學(xué)方法合成獲得，如叔丁基對苯二酚（TBHQ）、二丁基羥基甲苯（BHT）等[3-4]，另外還有一個重要的來源，即蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的抗氧化肽，后者不僅能夠清除氧自由基，而且同時具備螯合金屬離子、抑制脂肪氧合成酶等功能，且本身也是有一類重要的營養(yǎng)分子。因此，抗氧化肽已是當(dāng)前功能食品、保健品、藥品等研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)方向，例如來源于雞蛋的抗氧化性蛋白水解物[5]，來源于水產(chǎn)類肌肉或魚糜制備的抗氧化肽等[6-7]。

酪蛋白作為鮮牛奶中主要的蛋白質(zhì)成分，更是抗氧化肽制備的良好蛋白源。在胃腸道生理環(huán)境中，酪蛋白可先后被胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、腸肽酶等水解，生成結(jié)構(gòu)和功能多樣的二肽、三肽、寡肽、多肽等分子，抗氧化肽便是其中重要的一種類型。不過，胃腸道的天然環(huán)境具有穩(wěn)定的溫度、酸堿度、離子環(huán)境等，蛋白酶受到外界環(huán)境的影響較少，因此酪蛋白酶解產(chǎn)物的類型和產(chǎn)量相對穩(wěn)定。如果想針對性地提高抗氧化肽的生成比率，將其作為一種功能食品添加劑的成分來使用，那么構(gòu)建酪蛋白酶解制備抗氧化肽的體外水解體系就非常重要。

當(dāng)前，通過酪蛋白制備抗氧化肽已有研究[8-10]，但是鑒于不同地域、不同來源的鮮牛奶產(chǎn)品在化學(xué)組成和分子特性上的差異，本研究以寧波本地公司生產(chǎn)的鮮牛奶為原料，以酸性蛋白酶為工具酶，先后通過鮮牛奶粗蛋白制備、酸性蛋白酶酶解工藝探究、抗氧化活性檢測等，探索了該鮮牛奶原料在制備抗氧化混合肽過程中的優(yōu)化實(shí)驗方案，以便為食品、藥品等生產(chǎn)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

鮮牛奶（市售鮮奶，寧波本地奶業(yè)公司）；酸性蛋白酶（索萊寶，1∶50 000，北京）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（Sigma，美國）；甘氨酰-甘氨酰-酪氨酰-精氨酸四肽標(biāo)準(zhǔn)品（Gly-Gly-Tyr-Arg）（Peptides International，美國）；亮氨酸（Leu）（Amresco，美國）；三氯乙酸、雙縮脲試劑、甲醛、硼酸、β-巰基乙醇、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥基甲烷、鄰苯三酚、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸鹽等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 鮮奶粗蛋白的提取及蛋白含量檢測

參考呂桂善等[11]的方法并稍做修改。取1 kg鮮牛奶于大燒杯中，將其置于磁力攪拌器上邊攪拌邊加熱至80 ℃左右約30 min，之后4 000 r·min-1離心20 min，將其脫脂。用6 mol·L-1的鹽酸調(diào)脫脂鮮奶溶液pH到4.6，使蛋白沉淀。接著，4 000 r·min-1離心15 min去上清液。之后，用蒸餾水洗劑粗蛋白沉淀，調(diào)節(jié)其pH為中性，再次離心去除上清液，將沉淀冷凍干燥，即為鮮牛奶粗蛋白。粗蛋白中蛋白質(zhì)含量的檢測采用凱氏定氮法。

1.2.2 粗蛋白酸性蛋白酶水解物的制備與多肽水解率測定

參考白騰輝等方法并修改[12]。在50 mL蒸餾水中加入一定量的鮮牛奶粗蛋白（15 mg·mL-1），磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，根?jù)酸性蛋白酶標(biāo)示的pH值調(diào)節(jié)水解酸堿度，然后加入一定量的酸性蛋白酶，在一定溫度下的恒溫振蕩器內(nèi)水解，持續(xù)一段時間后，用100 ℃水浴10 min滅酶活以停止酶解反應(yīng)，將酶解混合液冷卻至室溫備用。

參考魯偉等[13]的多肽濃度檢測法測定酶解物的肽水解率。取2.5 mL粗蛋白酸性蛋白酶水解物，加入2.5 mL10%（W/V）的三氯乙酸（TCA）水溶液，漩渦混合儀混合均勻后靜置10 min，然后以4 000 r·min-1離心15 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移到50 mL的容量瓶中，并用5%的TCA定容至刻度，搖勻。之后，取6.0 mL上述溶液置于另一試管中，加入雙縮脲試劑4.0 mL（樣液∶雙縮脲試劑=3∶2，V/V），于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10 min，2 000 r·min-1離心10 min，取上清液于540 nm下測定OD值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中多肽濃度C（mg·mL-1），求得樣品中多肽含量。以不同濃度的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐標(biāo)X（mg·mL-1），以在OD540測得的吸光值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 粗蛋白酸性蛋白酶水解工藝的優(yōu)化

（1）單因素實(shí)驗。參考酸性蛋白酶的常見酶學(xué)參數(shù)，本實(shí)驗在39 ℃、pH=3、酶和底物組成比例為1∶40、水解時間為180 min的條件下測定多肽水解度。然后，分別設(shè)置各參數(shù)的調(diào)整范圍：溫度參數(shù)為37 ℃、39 ℃、41 ℃；pH值參數(shù)為1、3、5；酶和底物組成比例參數(shù)為1∶20、1∶40、1∶60；水解時間為60 min、180 min、300 min。在每組實(shí)驗中，固定其他3個參數(shù)而僅變化其中一個參數(shù)，逐一測定多肽水解度。

（2）正交實(shí)驗。根據(jù)單因素實(shí)驗結(jié)果，以各因素在單因素實(shí)驗中的最佳值為中心值向兩側(cè)再各設(shè)定2個水平，然后設(shè)置L25(54)正交實(shí)驗表，測定溫度、pH、酶和底物組成比例、酶解時間等因素和不同水平下的多肽水解度。

1.2.4 粗蛋白酸性蛋白酶水解物的抗氧化性測定

DPPH自由基清除能力。參考SPELLMAN和MCEVOY的方法[14]，取1 mg·mL-1的酸性蛋白酶水解物4 mL與200 μmol·L-1的DPPH溶液1 mL混合，避光下反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后于517 nm處檢測吸光值，以無水乙醇作為空白對照。按照以下公式計算：

式中：A517空白表示無水乙醇空白對照在517 nm處的吸光值；A517樣品表示樣品液在517 nm處的吸光值。

1.2.5 超氧陰離子清除能力

參考戚莉佳等方法[15]，取1 mL酸性蛋白酶水解物與1.8 mL 50 mmol·L-1的三羥基甲烷-鹽酸緩沖液混合，25 ℃恒溫反應(yīng)10 min，之后加入0.1 mL預(yù)先配制好的10 mmol·L-1的鄰苯三酚溶液，混合均勻后測OD320。測定時，每0.5 min讀數(shù)一次，直到4 min為止。以時間為橫坐標(biāo)X，以O(shè)D320的數(shù)值為縱坐標(biāo)Y，依據(jù)所測的結(jié)果繪制吸收率曲線。

式中：ΔA0表示1 mL去離子水的空白樣值；ΔA1表示曲線斜率。

1.2.6 統(tǒng)計分析

采用Excel 2019處理實(shí)驗數(shù)據(jù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）的形式表示。利用Minitab軟件設(shè)計正交實(shí)驗方案，數(shù)據(jù)分析和作圖采用GraphPad Prism生物統(tǒng)計軟件，p＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實(shí)驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次。

2 實(shí)驗結(jié)果

2.1 鮮牛奶粗蛋白的制備

實(shí)驗結(jié)果表明，鮮牛奶粗蛋白的抽提率為2.9%，鮮牛奶粗蛋白中蛋白含量為91.6%。因此，鮮牛奶蛋白抽提率為2.65%。

2.2 粗蛋白的堿性蛋白酶解

2.2.1 溫度單因素實(shí)驗結(jié)果

如圖1所示，在39 ℃時多肽濃度最高，隨著時間的延長，多肽的轉(zhuǎn)化率下降。因此，單因素實(shí)驗的溫度值選39 ℃。

圖1 不同溫度下酸性蛋白酶的多肽水解度圖

2.2.2 pH值單因素實(shí)驗結(jié)果

如圖2所示，在pH為3時多肽水解度最高，隨著pH值的升高，多肽轉(zhuǎn)化率下降。因此單因素實(shí)驗的pH值選2。

圖2 不同pH下酸性蛋白酶的多肽水解度圖

2.2.3 酶和底物組成比例單因素實(shí)驗結(jié)果

如圖3所示，酶和底物組成比例在橫坐標(biāo)上分別用1（酶∶底物=1∶20）、2（酶∶底物=1∶40）、3（酶∶底物=1∶60）來表示。從結(jié)果來看，在2號（酶∶底物=1∶40）狀態(tài)下，多肽轉(zhuǎn)化率高。隨著酶和底物組成比例的升高，多肽水解率緩慢下降。因此，此單因素實(shí)驗的酶和底物比例選用1∶ 40。

圖3 不同的酶和底物比例下酸性蛋白酶的多肽水解度圖

2.2.4 酶解時間單因素實(shí)驗

如圖4所示，多肽水解度隨著時間的延長逐步升高，在大約3 h達(dá)到最高點(diǎn)。因此，本單因素實(shí)驗的酶解時間值選3 h。

圖4 不同水解時間下酸性蛋白酶的多肽水解度圖

2.2.5 酸性蛋白酶酶解鮮牛奶粗蛋白的L25(54)正交實(shí)驗結(jié)果

選擇溫度、pH、酶和底物組成比例及水解時間為考察因素，以多肽水解度為評價指標(biāo)，設(shè)計正交試驗，正交試驗結(jié)果見表1。

表1 酸性蛋白酶酶解鮮牛奶粗蛋白的L25（54）正交實(shí)驗表

依據(jù)表1中的R值分析可知，影響酸性蛋白酶酶解鮮奶粗蛋白的多肽水解度的影響因素主次順序為溫度＞酶和底物組成比例＞pH＞水解時間。依據(jù)k值變化發(fā)現(xiàn)，給定條件的最佳組合為：在37 ℃，pH為3，酶和底物組成比例為1∶30的條件下，水解60 min的效果最好,多肽水解度可達(dá)到（31.00±0.50）%，結(jié)果比單因素實(shí)驗和正交實(shí)驗的水解度都高，實(shí)驗重復(fù)3次，具有較高的重現(xiàn)性。實(shí)驗結(jié)果表明，該工藝組合穩(wěn)定可行。

2.3 鮮牛奶粗蛋白酶解物抗氧化性活性測定

2.3.1 DPPH自由基清除能力

測定最佳酶解條件下的鮮奶粗蛋白酶解物對DPPH的最佳清除率為（50.28±0.28）%。

2.3.2 超氧陰離子清除能力

在此條件下，鮮奶粗蛋白酶解物對超氧陰離子的清除能力為（31.59±0.22）%。

3 討論

本研究開展了堿性蛋白酶法水解鮮牛奶粗蛋白制備ACEI混合肽的實(shí)驗，借助L25(54)的正交實(shí)驗最終確定了在溫度在37 ℃、pH為3，酶和底物組成比例為1∶30、水解時間為60 min的條件下可獲得較好的抗氧化肽混合肽產(chǎn)物。在此條件下，鮮牛奶粗蛋白的多肽水解液的水解率為（31.00±0.50）%，對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）的清除能力約為（50.28±0.28）%，對超氧陰離子的清除效果約為（31.59±0.22）%。

在工藝摸索的實(shí)驗中，各因素表現(xiàn)出幾個明顯的特點(diǎn)。①伴隨著溫度上升，多肽水解率會提高，這是因為酶的分子運(yùn)動增強(qiáng)所致。然而溫度過高而與最適溫度偏差過大的話，酶的結(jié)構(gòu)會受到破環(huán)，活性受到影而，水解效果自然下降。②對于酸性蛋白酶而言，采用酶所標(biāo)示的pH值稍小一點(diǎn)的酸堿度能顯示出更好的水解效果。③過高的酶和底物組成比例不利于酶活性的發(fā)揮，反之酶的催化底物不夠，都會不同程度影響多肽水解度。④水解效率一般會隨著水解時間的延長而增加，但是水解到一定程度后，受酶、底物濃度下降和多肽生成量干擾，時間持續(xù)延長并不利于產(chǎn)物的生成。

自從1979年BRANTLE等從牛乳酪蛋白酶解產(chǎn)物中獲得一個由7個氨基酸組成的短肽以來，牛奶酪蛋白已經(jīng)成為生物活性肽制備的主要原料之一。陳旭峰曾研究用胰酶法制備酪蛋白抗氧化肽混合物，在50 ℃、pH為7.5、水解時間為120 min、酶和底物組成比例約為1∶25的情況下，獲得了30.1%的多肽水解度，此實(shí)DPPH自由基清除率為68.1%。相比而言，本實(shí)驗采用的是酸性蛋白酶，水解的是鮮牛奶粗蛋白混合物，鑒于牛奶原料的差異和酶功能的區(qū)別，酶在發(fā)揮作用時表現(xiàn)出明顯差異，即堿性蛋白酶的水解效果要優(yōu)于酸性蛋白酶。

綜上所述，蛋白酶解條件和工藝對目標(biāo)肽的制備具有重要影響。水解程度過大，則游離氨基酸產(chǎn)物過多，酶解物的抗氧化性會變??；假若水解程度小，則蛋白質(zhì)可能水解不完全，目標(biāo)肽的生成也會受到干擾。因此，探討合適的水解條件對獲得較好的實(shí)驗結(jié)果來說至關(guān)重要。本研究為后續(xù)繼續(xù)開展抗氧化肽類研究工作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。