張 鑫，謝 苗，亓小妮，郭雅琳，劉養(yǎng)山，張 景，杜秀菊

（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252000）

靈芝是中藥之寶，素有“仙草”之美譽(yù)。最早關(guān)于靈芝的記載是《神農(nóng)本草經(jīng)》，其中評(píng)價(jià)靈芝為“上上之藥，方中妙品”[1]，現(xiàn)代藥理學(xué)和臨床實(shí)踐進(jìn)一步證實(shí)了靈芝的藥理作用，并證實(shí)了多糖和三萜是靈芝的主要活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、保肝護(hù)肝、降血糖、治療神經(jīng)衰弱等藥理作用，可以強(qiáng)身健體，延年益壽[2]。目前，靈芝常以生藥材、藥用制劑、保健品飲品等商品面向市場(chǎng)[3]。

我國(guó)藥渣年產(chǎn)量每年高達(dá)3.4×107t，大多作為廢棄物堆放、填埋或焚燒[4]，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。研究表明，藥渣保留了粗纖維和粗脂肪等有效成分，是培養(yǎng)藥用真菌的優(yōu)良原料[5]。

為找出適合中藥渣培養(yǎng)的靈芝品種，對(duì)9種來(lái)源不同的靈芝菌株進(jìn)行了菌種長(zhǎng)勢(shì)觀察和出芝試驗(yàn)，基于ITS基因序列同源性關(guān)系建立系統(tǒng)發(fā)育樹并鑒定其親緣關(guān)系[6]。為合理開發(fā)中藥渣剩余價(jià)值變廢為寶提供理論依據(jù)，對(duì)靈芝產(chǎn)業(yè)的代料栽培拓展空間。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株來(lái)源

9種靈芝菌株名稱及來(lái)源見下表1。

表1 供試菌株編號(hào)及其來(lái)源Tab.1 Numbers and sources of tested strains

如表1所示，9種靈芝菌株中，7種菌株購(gòu)于武漢周玉麟食用菌研究所，其他2種靈芝菌株（LD-202023.2和LD-202083.8） 為聊城大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室從靈芝組織中分離獲得，其子實(shí)體來(lái)源于山東冠縣靈芝栽培基地，冠縣是全國(guó)最大靈芝栽培基地，但冠縣靈芝長(zhǎng)期存在量多價(jià)低的現(xiàn)象。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基CPDA：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g，補(bǔ)足純水至1 000 mL，pH自然。

菌種擴(kuò)繁培養(yǎng)基CYPDA：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、藥渣200 g，純水補(bǔ)足至1 000 mL，pH自然。

菌絲體培養(yǎng)液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、藥渣200 g，純水補(bǔ)足至1 000 mL，pH自然。

二級(jí)藥渣栽培料配方：中藥渣60%、麥麩38%、石膏1%、葡萄糖1%、磷酸二氫鉀0.4%，料液比約為 1∶1.1～1∶1.3。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及擴(kuò)繁

在無(wú)菌環(huán)境下，從9株靈芝菌種的CPDA試管培養(yǎng)基中，挑取菌絲濃、白、健壯的小塊菌絲體接入到CYPDA擴(kuò)繁平板培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)5 d～7 d。

1.2.2 靈芝菌株的平板菌絲長(zhǎng)勢(shì)

用打孔器從每塊擴(kuò)繁平板中均勻選取相同數(shù)量、大小相等的純化菌絲體接入到新的CYPDA平板培養(yǎng)基中，每個(gè)平板接種1塊。每日測(cè)量菌塊直徑大小，觀察其形態(tài)、色澤、密度、邊緣整齊程度[7]，計(jì)算菌絲的日生長(zhǎng)速率，每個(gè)菌株設(shè)置3次平行試驗(yàn)。

1.2.3 液體培養(yǎng)基中菌絲長(zhǎng)勢(shì)

1.2.1中的CYPDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d～7 d后，選取2塊直徑1 cm的圓形菌塊，接入到150 mL液體培養(yǎng)基。接種后的液體培養(yǎng)基于搖床25℃、150 r·min-1恒溫避光培養(yǎng)1周，觀察菌絲球形態(tài)、顏色、大小、密度、培養(yǎng)基顏色及生物量等指標(biāo)[8]。

1.2.4 瓶式栽培培養(yǎng)基中菌絲長(zhǎng)勢(shì)

通過(guò)一級(jí)培養(yǎng)（1.2.2和1.2.3）觀察菌絲在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的長(zhǎng)勢(shì)，篩選出長(zhǎng)勢(shì)較好的靈芝菌種進(jìn)行瓶栽二級(jí)培養(yǎng)。觀察菌絲在二級(jí)藥渣栽培料中適應(yīng)程度及生長(zhǎng)特征，進(jìn)一步篩選出藥渣適栽培優(yōu)良靈芝菌種。

1.2.5 菌絲體DNA提取及凝膠電泳檢測(cè)

DNA的提取參照童森淼等[9]和張杰等[10]的方法，并略有改進(jìn)。選取形態(tài)大小適宜的菌絲球，用無(wú)菌水清洗后離心去沉淀，-80℃冷凍過(guò)夜用于提取DNA[11]。冷凍的菌絲體經(jīng)高通量組織研磨器研磨，使用CTAB法提取DNA，苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1） 去除蛋白，異丙醇沉淀DNA，酒精洗滌，在TE緩沖液中溶解并保存。1.0%的瓊脂糖凝膠，50×TAE為電泳緩沖液，上樣量為1 μL，121 V電壓電泳35 min，檢測(cè)DNA樣品純度[12]。

1.2.6 ITS-PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

采用真菌核糖體基因間隔區(qū)通用引物ITS1和ITS4（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC） 進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13]。引物由金唯智生物科技有限公司合成，擴(kuò)增在Bio-Rad T100 PCR儀上進(jìn)行。

采用25 μL反應(yīng)體系：2×Taq mix（東盛生物科技有限公司） 12.5 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 8.5 μL，下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在UVP凝膠成像系統(tǒng)下成像保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由金唯智生物科技有限公司進(jìn)行單向測(cè)序。測(cè)得的序列用BioEdit軟件處理后提交至GenBank[14]。

1.2.7 ITS序列分析

測(cè)得的序列根據(jù)GenBank上已有的靈芝菌株序列運(yùn)用Blast對(duì)獲得的同源序列進(jìn)行對(duì)比分析。通過(guò)對(duì)9個(gè)樣品的ITS序列對(duì)比，用BioEdit對(duì)構(gòu)樹進(jìn)行編輯[15]，再用Muscle進(jìn)行多次序列排列，最后用MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：按照N.J.（Neighbor-joining） 鄰接法，以猴頭菌屬（Hericium） 為外群，經(jīng)Bootstrap重復(fù)構(gòu)建循環(huán)1 000次，來(lái)檢驗(yàn)所構(gòu)建進(jìn)化樹的可靠性。

2 結(jié)果分析

2.1 試驗(yàn)靈芝菌株的菌絲長(zhǎng)勢(shì)

采用Duncan新復(fù)極差法[16]，得到9個(gè)靈芝菌株在相同CYPDA藥渣培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況，詳見表2。

表2 9種靈芝菌株的平板菌絲長(zhǎng)勢(shì)Tab.2 mycelial growth of nine Ganoderma lucidum strains on plate

如表2所示，韓芝1（LD-202023.2） 生長(zhǎng)速度最快，可達(dá)（2.19±0.35） cm·d-1；其次是大紅芝 （LD-202033.3） 和紫芝 （LD-202083.8） 生長(zhǎng)速度較快，分別達(dá)到 （1.85±0.23） cm·d-1和（1.81±0.26） cm·d-1；美芝 （LD-202053.5） 和韓芝 （LD-202013.1） 生長(zhǎng)速度較慢，分別為（0.71±0.12） cm·d-1和 （0.72±0.20） cm·d-1。

2.2 液體培養(yǎng)基菌種長(zhǎng)勢(shì)

在25℃、150 r·min-1恒溫避光搖床的相同培養(yǎng)條件下，9種靈芝菌株在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況見表3。

表3 9種靈芝菌株液體培養(yǎng)長(zhǎng)勢(shì)Tab.3 Growth of nine Ganoderma lucidum strains with liquid cultivation

如表3所示，韓芝（LD-202013.1）、泰山靈芝（LD-202043.4）、鹿角靈芝 （LD-202063.6） 和 G10（LD-202093.9） 的菌絲球?yàn)榇虪?；大紅芝（LD-202033.3） 和紫芝 （LD-202083.8） 的菌絲球?yàn)樗鬆?；美?（LD-202053.5） 和黑芝 （LD-202073.7）的菌絲球?yàn)閳A球狀；韓芝1（LD-202023.2） 的菌絲球?yàn)轭w粒狀。韓芝1（LD-202023.2）、大紅芝（LD-202033.3） 和紫芝（LD-202083.8） 的菌絲球數(shù)量較多且生長(zhǎng)較快，且除韓芝 （202013.1） 和美芝（202053.5）以外，其他菌株的菌絲球大小都均勻。

2.3 瓶式栽培培養(yǎng)基中菌絲長(zhǎng)勢(shì)

結(jié)合平板培養(yǎng)和液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)情況，挑選了韓芝1（LD-202023.2）、大紅芝（LD-202033.3）、泰山（LD-202043.4）、黑芝（LD-202073.7）、紫芝（LD-202083.8） 5個(gè)菌種進(jìn)行瓶式栽培，培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)狀況見表4。

表4 瓶式栽培培養(yǎng)基中5種靈芝菌種的菌絲長(zhǎng)勢(shì)Tab.4 Mycelial growth of five Ganoderma lucidum strains in bottle culture medium

如表4所示，在藥渣培養(yǎng)基中，大紅芝、韓芝、紫芝3個(gè)菌株的菌絲生長(zhǎng)速度較快且菌絲最為粗壯、濃密、純白。黑芝和泰山靈芝，生長(zhǎng)速度較慢，菌絲長(zhǎng)勢(shì)一般。菌株的菌絲長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)弱可以作為評(píng)價(jià)靈芝菌株優(yōu)劣的重要指標(biāo)[17]，綜合各項(xiàng)指標(biāo)，大紅芝、韓芝、紫芝3個(gè)菌株更適合于藥渣培養(yǎng)基進(jìn)行栽培。

2.4 子實(shí)體形態(tài)及生物學(xué)效率比較

一級(jí)、二級(jí)培養(yǎng)優(yōu)良菌株中，選擇韓芝1（LD-202023.2）、紫芝（LD-202083.8） 2種長(zhǎng)勢(shì)較好的靈芝菌株進(jìn)行三級(jí)栽培管理，采用直徑10 cm、長(zhǎng)30 cm的高密度聚乙烯菌袋。其菌蓋生長(zhǎng)情況和生物學(xué)效率見表5。

表5 子實(shí)體形態(tài)及生物學(xué)效率Tab.5 Fruit body morphology and biological efficiency

如表5所示，紫芝（LD-202083.8） 和韓芝1（LD-202023.2）的生物學(xué)效率均達(dá)到30%以上。

2.5 DNA電泳圖分析

9個(gè)靈芝ITS-PCR電泳圖見圖1。

圖1 供試靈芝菌種ITS-PCR電泳圖Fig.1 ITS-PCR electrophoresis of tested Ganoderma lucidum strains

如圖1所示，9個(gè)靈芝菌株樣品均有較為清晰的擴(kuò)增條帶，菌株的ITS-PCR序列的片段在750 bp左右，在長(zhǎng)度上具有比較好的保守性，表明此特異引物具有較強(qiáng)的特異性，適用于靈芝菌種的分子鑒定[18]。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

測(cè)序結(jié)果登錄NCBI經(jīng)Blast比對(duì)。韓芝1（LD-202023.2） 與 NR 164049.1（G.sandunense） 的期待值（E值）為0，有效序列長(zhǎng)度高達(dá)97%，相似度為95.95%；大紅芝 （LD-202033.3） 與 NR 132919.1（G.desttructans） 的期待值為0，有效序列長(zhǎng)度高達(dá)100%，相似度為94.77%；紫芝（LD-202083.8） 與NR 132919.1（G.desttructans） 的期待值為0，有效序列長(zhǎng)度高達(dá)100%，相似度為94.86%，確定這三個(gè)菌株均為Ganoderma的不同株系。選取相似度高的前7個(gè)序列，基于ITS基因使用鄰近法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

由圖2可以看出，菌株韓芝（LD-202013） 與NR 152892.1（G.sichuanense）、泰山靈芝 （LD-202043.4）、美芝（LD-202053.5）、鹿角靈芝（LD-202063.6）、G10（LD-202093.9） 等菌株的 ITS序列同源性較高，序列一致為99.26%；黑芝（LD-2020273.7） 與 NR 164048.1 （G.nasalanense） 菌株的同源性較高，序列一致性為94.21%；紫芝（LD-202083.8） 與韓芝1（LD-202023.2）、大紅芝（LD-202033.3）的菌株的同源性較高。

圖2 基于ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS

系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，韓芝（LD-202013.1）、泰山靈芝 （LD-202043.4）、美芝 （LD-202053.5）、鹿角靈芝 （LD-202063.6）、G10（LD-202093.9） 與NR 164435.1（G.meredithae） 聚為一支，與 NR 152892.1（G.sichuanense）的遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近；黑芝（LD-2020273.7） 與NR 158431.1（G.angustisporum） 聚為一支，與NR 164048.1（G.nasalanense）的遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近[19]；菌株紫芝（LD-202083.8）與韓芝1（LD-202023.2）、大紅芝（LD-202033.3）聚為一支且遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過(guò)一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)菌種的藥渣栽培試驗(yàn)，以9個(gè)菌株的菌絲長(zhǎng)勢(shì)和靈芝子實(shí)體性狀為主要依據(jù)進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，韓芝1（LD-202023.2）、大紅芝（LD-202033.3） 和紫芝（LD-202083.8） 更適合藥渣栽培。

已有的研究表明，靈芝屬ITS序列的種間序列相似性低于94%，種內(nèi)相似性高于98%[20]。通過(guò)對(duì)9種靈芝菌株的ITS序列與NCBI中檢索的7種相似序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，表明韓芝（LD-202013.1）、黑芝 （LD-2020273.7） 分別與 NR 164435.1（G.meredithae）、NR 132919.1 （G.destructans） 相似度高達(dá)100%，應(yīng)屬于同一種；紫芝（LD-202083.8） 與韓芝1（LD-202023.2）、大紅芝（LD-202033.3） 相似度高達(dá)99%，應(yīng)屬于同一種[21]。

適合藥渣栽培的3個(gè)菌株：韓芝1（LD-202023.2）、大紅芝 （LD-202033.3） 和紫芝 （LD-202083.8），韓芝1菌絲長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，為藥渣栽培的最佳菌株。得到最佳菌株，即可充分利用藥渣的剩余價(jià)值，變廢為寶，有望能夠完全或部分替代木糖醇渣或棉籽殼等傳統(tǒng)主料，節(jié)約成本、提高投入產(chǎn)出比，有助于鄉(xiāng)村振興，促進(jìn)生態(tài)文明建設(shè)。