石勝柳，丁 桃，孫 瑜，盛祖桃，徐 婧，蔡 晶，王增亮

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，云南昆明 650031；2.云南博亞醫(yī)院心臟中心心功能室，云南昆明 650031；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，新疆烏魯木齊 830000）

創(chuàng)傷性脊髓損傷（traumatic spinal cord injury,t-SCI）是由于物理因素導(dǎo)致的脊髓急劇損傷，主要臨床表現(xiàn)為脊髓內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)紊亂和膀胱括約肌失控導(dǎo)致的排尿功能阻礙，主要病理表現(xiàn)為脊髓神經(jīng)元軸突變性和神經(jīng)元凋亡等[1]。軸突具有運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等功能，是神經(jīng)元的重要組成部分[2]。已有研究表明，刺激神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)傳出，促進(jìn)軸突再生，從而可以改善膀胱的自主性收縮[3]。目前，t-SCI主要治療方案為手術(shù)緩解脊髓損傷，藥物促進(jìn)脊髓神經(jīng)元和軸突再生，進(jìn)而改善器官功能，但這些治療措施對(duì)t-SCI的治療效果有限[4]。因此，尋找t-SCI的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的生物活性物質(zhì)，具有促進(jìn)脊髓中神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和再生的功能[5]。研究表明，30~60 μg NGF干預(yù)t-SCI大鼠后，NGF可通過抑制神經(jīng)元凋亡，改善脊髓損傷[6-7]。但NGF對(duì)t-SCI的膀胱功能以及脊髓神經(jīng)軸突修復(fù)作用尚不清楚。本研究通過改良Allen’s擊打法構(gòu)建t-SCI大鼠，NGF腹腔注射治療，采用BBB評(píng)估、大鼠尿動(dòng)力學(xué)、左側(cè)腰6前根(L6VR)甲苯胺藍(lán)染色和蛋白免疫法（Western blotting）等方法，觀察NGF對(duì)t-SCI大鼠膀胱功能和脊髓神經(jīng)軸突修復(fù)的影響，以及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組SPF級(jí)的雄性SD大鼠30只（廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），12周齡，體質(zhì)量（220±5）g，飼養(yǎng)于恒溫（22±2）℃、50%~60%濕度且無特殊病原體的動(dòng)物房中，自由攝入水和飼料。大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、損傷組和NGF組，每組各10只。1 mL/L烏拉坦溶液（1.0 g/kg）腹腔注射麻醉大鼠，將其背部毛發(fā)剃光后，用含750 g/L乙醇棉消毒后，鋪洞巾。以T8棘突為中心，正中切5 cm切口，充分暴露T7~T11棘突，再用手術(shù)鉗固定T8棘突，制造脊髓為中心的3 mm圓形損傷區(qū)。通過改良Allen，通擊打儀器，10 g沖擊針從3 cm高度自由落體撞擊脊髓，在撞擊的時(shí)候，大鼠尾部蜷縮，雙下肢發(fā)生回縮彈動(dòng)，然后癱瘓，說明脊髓損傷模型構(gòu)建成功[8]。常規(guī)縫合消毒放回飼養(yǎng)籠。從手術(shù)第一天起，假手術(shù)組、損傷組大鼠每日20 μL手術(shù)生理鹽水腹腔注射，NGF組的大鼠給予20 μL生理鹽水混合60 μg NGF，腹腔注射，干預(yù)6周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑及試劑盒烏拉坦（北京通縣育才精細(xì)化工廠），NGF（賽默飛世爾科技有限公司），40 g/L多聚甲醛（北京雷根生物技術(shù)有限公司），甲苯胺（江蘇福斯特化工制造有限公司），RIPA緩沖液、PMSF、蛋白磷酸酶抑制劑和BeyoECL發(fā)光液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），BSA（德寧生物技術(shù)有限公司），兔抗鼠Raf-1、MEK-2、p-MEK-2、ERK1/2、p-ERK1/2和GAPDH單分子抗體（Abcam），山羊抗兔二抗（CST）。

1.3 后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分采用BBB評(píng)分[9]評(píng)價(jià)假手術(shù)組、損傷組和NGF組術(shù)前和術(shù)后30 min的后肢運(yùn)動(dòng)能力。根據(jù)3組大鼠后肢關(guān)節(jié)靈活度、后肢的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力以及爪子的精細(xì)運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行評(píng)分。0分為大鼠完全癱瘓，滿分21分為大鼠正?；顒?dòng)，BBB評(píng)分越低，說明大鼠運(yùn)動(dòng)能力越差。BBB評(píng)分由2人獨(dú)立進(jìn)行評(píng)估，平均值為最終評(píng)分。

1.4 大鼠尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)假手術(shù)組、損傷組和NGF組大鼠干預(yù)6周后，在20 mL/L七氟烷吸入下麻醉大鼠，打開大鼠腹部，在恥骨上膀胱頂部造瘺并且將3號(hào)輸尿管插入，再將腹部縫合。放入測(cè)壓籠內(nèi)，設(shè)置室溫為30℃。輸尿管導(dǎo)管接上三通，用注射器抽出膀胱尿液后，三通一端與微量灌注泵相接，另一端接尿動(dòng)力儀的膀胱壓力傳感器，體內(nèi)置零。在膀胱灌注生理鹽水（速度為2.5 mL/h），至大鼠開始排尿時(shí)停止注水。再將測(cè)壓管與BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連接。雙極電極刺激（10 Hz，1 ms，0.5 mA）吻合口近端的腰4前根(L4VR)，記錄逼尿肌最大壓力和膀胱內(nèi)剩余尿量。

1.5 HE染色檢測(cè)大鼠膀胱組織病理形態(tài)分離假手術(shù)組、損傷組和NGF組各10只大鼠膀胱組織，40 g/L多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋固定后，冷凍切片機(jī)切10 μm薄切片，每只大鼠隨機(jī)選取2張切片進(jìn)行HE染色，倒置顯微鏡觀察各組大鼠膀胱組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6 TUNEL檢測(cè)大鼠脊髓凋亡選取干預(yù)6周的假手術(shù)組、損傷組和NGF組大鼠各5只，麻醉后分離損傷嚴(yán)重的脊髓0.5 cm。通過石蠟包埋，超薄切片機(jī)切片，通過二甲苯脫蠟，梯度乙醇洗脫后，浸入H2O2封閉液中，室溫封閉10 min，依次加入TdT酶反應(yīng)液和FITC標(biāo)記工作液。37℃避光孵育60 min后，放入熒光顯微鏡，400倍視野觀察，取5個(gè)視野的平均數(shù)。

1.7 有髓軸突計(jì)數(shù)假手術(shù)組、損傷組和NGF組另5只大鼠干預(yù)6周后，腹腔注射10 g/L水合氯醛進(jìn)行麻醉，背部正中切口，分離截取吻合口遠(yuǎn)端10 mm長(zhǎng)度的L6VR。放入40 g/L多聚甲醛灌注固定24 h，脫水，環(huán)氧樹脂包埋，再用超薄切片機(jī)切1 μm薄切片10 g/L甲苯胺藍(lán)染色后，激光共聚焦顯微鏡觀察5個(gè)視野的有髓軸突數(shù)量，記錄5個(gè)視野的平均數(shù)。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平從假手術(shù)組、損傷組和NGF組大鼠分離采集脊髓損處0.5 cm的脊髓樣品。用液氮研磨后，加入裂解混懸液（RIPA緩沖液∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制劑=1∶100∶100），放入勻漿機(jī)充分勻漿，12 500 g，4℃，離心15 min，取上清液，BCA試劑檢測(cè)總蛋白的濃度，將各組的濃度調(diào)制一致。總蛋白通過電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，30 g/L BSA封閉2 h。將膜放入以1∶1 000稀釋的一抗Raf-1、MEK-2、p-MEK-2、ERK1/2、p-ERK1/2和GAPDH中，4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次15 min，在二抗混合液（二抗：30 g/L BSA=1∶4 000）室 溫 孵 育2 h。TBST洗 滌3次，每 次15 min，Beyo ECL發(fā)光液孵育條帶1 min后，放入凝膠顯影儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。通過Image J軟件進(jìn)行分析結(jié)果，計(jì)算各組目的條帶與GAPDH比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠術(shù)前和術(shù)后BBB評(píng)分情況BBB評(píng)分結(jié)果顯示，術(shù)前各組之間的BBB評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后與假手術(shù)組比較，損傷組和NGF模型組的BBB分?jǐn)?shù)顯著降低（P＜0.05）。與損傷組比較，NGF組術(shù)后的BBB分?jǐn)?shù)顯著增加（P＜0.05）。說明假手術(shù)組、損傷組和NGF組的大鼠t-SCI模型構(gòu)建成功（表1）。

表1 3組大鼠術(shù)前和術(shù)后脊髓功能BBB評(píng)分Tab.1 BBB scores of spinal cord function of the three groups of rats before and after operation （±s，n=10）

表1 3組大鼠術(shù)前和術(shù)后脊髓功能BBB評(píng)分Tab.1 BBB scores of spinal cord function of the three groups of rats before and after operation （±s，n=10）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05。

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2.2 各組大鼠尿動(dòng)力學(xué)和膀胱組織病理形態(tài)學(xué)變化尿動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，損傷組的最大逼尿壓力顯著降低（P＜0.05），而殘余尿量顯著增加（P＜0.05）。與損傷組比較，NGF組的最大逼尿壓力顯著增加（P＜0.05），而殘余尿量顯著降低（P＜0.05，表2）。

表2 3組大鼠最大逼尿壓力和殘余尿量的比較Tab.2 Comparison of maximum detrusive pressure and resid?ual urine volume in the three groups of rats （±s，n=10）

表2 3組大鼠最大逼尿壓力和殘余尿量的比較Tab.2 Comparison of maximum detrusive pressure and resid?ual urine volume in the three groups of rats （±s，n=10）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與損傷組比較，#P＜0.05。

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HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組上皮細(xì)胞排列整齊，逼尿肌細(xì)胞大小一致，肌纖維排列有序，肌束之間緊密排列，無水腫現(xiàn)象。損傷組肌纖維肥大，黏膜層出血，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，嚴(yán)重水腫。NGF組膀胱水腫減輕，逼尿肌增厚，少數(shù)細(xì)胞變性，無出血現(xiàn)象[1-2](圖1)。

圖1 3組膀胱組織HE染色結(jié)果Fig.1 HE staining of the three groups of bladder tissues(scale bar=10 μm,×100)

2.3 各組大鼠脊髓凋亡率的變化TUNEL染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組脊髓組織TUNEL陽性率顯著升高（P＜0.05），NGF組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與損傷組比較，NGF脊髓組織TUNEL陽性率顯著降低（P＜0.05，表3，圖2）。

圖2 3組大鼠脊髓TUNEL染色結(jié)果Fig.2 TUNEL staining of the spinal cord of three groups of rats(scale bar=10 μm,×400)

表3 3組大鼠脊髓TUNEL凋亡率比較Tab.3 Comparison of TUNEL apoptosis rate in the spinal cord of three groups of rats [（±s)%，n=10]

表3 3組大鼠脊髓TUNEL凋亡率比較Tab.3 Comparison of TUNEL apoptosis rate in the spinal cord of three groups of rats [（±s)%，n=10]

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與損傷組比較，#P＜0.05。

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2.4 各組大鼠髓軸突的數(shù)量假手術(shù)組、損傷組和NGF組吻合口遠(yuǎn)端L6VR髓軸突數(shù)量分別為(553.2±36.2)、(224.5±41.4)、(455.3±40.5)個(gè)。與 假手術(shù)組比較，損傷組大鼠吻合口遠(yuǎn)端L6VR髓軸突數(shù)量顯著降低（P＜0.05），NGF組髓軸突數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與損傷組比較，NGF組髓軸突數(shù)量顯著增加（P＜0.05,圖3）。

2.5 各組大鼠脊髓中MAPK/ERK信號(hào)通路蛋白表達(dá)的變化Western blotting結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，損傷組大鼠脊髓組織MAPK/ERK通路中p-ERK1/2/ERK1/2和p-MEK-2/MEK-2蛋白比值以及Raf-1蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），NGF組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與損傷組比較，NGF組的p-ERK1/2/ERK1/2和p-MEK-2/MEK-2蛋白比值以及Raf-1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖4，表4）。

表4 3組ERK通路蛋白表達(dá)量情況Tab.4 ERK pathway protein expressions in the three groups（±s，n=10）

表4 3組ERK通路蛋白表達(dá)量情況Tab.4 ERK pathway protein expressions in the three groups（±s，n=10）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與損傷組比較，#P＜0.05。

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圖4 3組大鼠脊髓中ERK通路蛋白變化情況Fig.4 Changes of ERK pathway proteins in the spinal cord of the three groups of rats

3 討 論

創(chuàng)傷性脊髓損傷是損傷水平以下部位的脊髓功能受到阻礙[10]。脊髓受損后，軸突再生和受損神經(jīng)元的重塑受到抑制，導(dǎo)致微環(huán)境的紊亂，引起二次損傷[11]。膀胱功能障礙是常見t-SCI并發(fā)癥，主要臨床特征為尿潴留、尿失禁和殘余尿量增多等，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)泌尿系統(tǒng)感染和腎功能損傷，甚至危及生命[12]。目前，治療t-SCI首選藥物為糖皮質(zhì)激素，但長(zhǎng)時(shí)間使用會(huì)引起出血和應(yīng)激性潰瘍等并發(fā)癥，并且對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)效果有限[13]。已有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的NGF調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、成熟和存活過程，是神經(jīng)元發(fā)育中至關(guān)重要的物質(zhì)[14]。脊髓損傷時(shí)，NGF隨之表達(dá)量增加，但是由于其表達(dá)水平仍較低，無法持久保護(hù)損傷的神經(jīng)元。NGF是神經(jīng)保護(hù)劑和再生劑，常用于臨床中神經(jīng)損傷癥狀，其可治療t-SCI。因此，需要借助外源性NGF促進(jìn)t-SCI患者運(yùn)動(dòng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)[15]。但NGF對(duì)t-SCI大鼠的膀胱功能改善以及軸突損傷修復(fù)的機(jī)制尚不明確。基于此，本研究通過腹腔注射NGF于t-SCI大鼠模型，觀察大鼠膀胱的最大逼尿壓力和殘余尿量，以及膀胱組織病理形態(tài)學(xué)變化，檢測(cè)脊髓中軸突的再生情況和TUNEL凋亡率以及MAPK/ERK信號(hào)通路的變化。

本研究BBB評(píng)分顯示，改良Allen’s擊打法后，與假手術(shù)組比較，損傷組和NGF組的大鼠評(píng)分顯著降低，說明改良Allen’s擊打法構(gòu)建t-SCI大鼠模型成功。與假手術(shù)比較，損傷組中的膀胱功能以及病理組織均受損，這可能是因?yàn)榧顾钃p傷會(huì)出現(xiàn)膀胱或括約肌失去神經(jīng)支配而產(chǎn)生排尿功能障礙，從而發(fā)生尿潴留，尿路感染。NGF可以增加t-SCI大鼠的最大逼尿壓力，減少殘余尿量，并且NGF可以促進(jìn)膀胱組織的水腫消退和組織排列，說明NGF可以恢復(fù)t-SCI大鼠的膀胱功能。吻合口遠(yuǎn)端L6VR髓軸突數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，脊髓損傷后，大鼠的軸突數(shù)量明顯減少，而NGF的干預(yù)后，軸突數(shù)量明顯增加，促進(jìn)t-SCI大鼠的軸突再生。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，損傷組的脊髓凋亡率增加。t-SCI大鼠通過NGF干預(yù)后，脊髓凋亡率明顯減低，說明，NGF可以抑制脊髓凋亡，促進(jìn)軸突再生。

MAPK/ERK通路主要是ERK分子磷酸化形成活性的p-ERK，隨后入核參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程[16]。MAPK信號(hào)通路與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Ras/Raf/ERK信號(hào)通路屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的家庭成員之一，是膜受體信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞的重要途徑，主要參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和凋亡等過程[12]。Ras/Raf/ERK信號(hào)通路屬于三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，Ras是上游激酶蛋白，與GTP結(jié)合后，其磷酸化后處于活化狀態(tài)，進(jìn)一步激活下游Raf分子，使Raf磷酸化后，最后催化下游分子ERK[13]。MAPK信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)重要信號(hào)傳遞通路，參與調(diào)節(jié)多種生理過程，其中ERK信號(hào)途徑是MAPK信號(hào)通路的重要組成部分，其異常傳導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞骨架解體，從而使軸突無法逆轉(zhuǎn)變性[17]。脊髓中MAPK/ERK信號(hào)通路抑制后，能改善脊髓損傷大鼠膀胱功能，抑制脊髓中ERK通路，可以促進(jìn)脊髓損傷中軸突的再生[18]。本研究Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，t-SCI大鼠的MAPK/ERK通路被激活，但NGF干預(yù)后，MAPK/ERK信號(hào)通路被抑制，說明NGF對(duì)t-SCI大鼠脊髓的MAPK/ERK信號(hào)通路可能具有抑制作用。

綜上所述，NGF可能抑制t-SCI大鼠脊髓中MAPK/ERK通路，從而促進(jìn)大鼠膀胱的功能恢復(fù)和軸突再生能力。本研究結(jié)果顯示，NGF對(duì)t-SCI的并發(fā)癥膀胱功能障礙具有一定的改善作用，并且其可能通過抑制脊髓中MAPK/ERK通路和激活軸突再生功能有關(guān)。NGF對(duì)t-SCI的MAPK/ERK信號(hào)通路的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。