仲津漫，丁健科，鄧 蕾，向 穎，劉朵朵，楊全新

（1.西安交通大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)學影像科，陜西西安 710004；2.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院整形外科，陜西西安 710032）

前列腺癌是嚴重威脅男性健康的泌尿生殖系惡性腫瘤[1]。早期多數(shù)前列腺癌患者對雄激素剝奪治療有效，但在歷經(jīng)3~5年的緩解期后，約20%的患者會由激素依賴性前列腺癌（androgen-dependent prostate cancer,ADPC）發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌（castra?tion-resistant prostate cancer,CRPC）[2]。CRPC患 者極易發(fā)生骨轉移，生存率較低。在前列腺癌發(fā)展為CRPC早期，如能在分子水平及早發(fā)現(xiàn)并給予有效治療方案，可延緩腫瘤進展速度，延長患者生存期，提高患者終末期生活質量。

適配體是一段由短鏈RNA或單鏈DNA（singlestranded DNA,ssDNA）折疊形成的具有特定二維或三維結構的寡聚核苷酸[3]。與抗體類似，適配體能以高親和力、高特異性結合相應靶標，此外，適配體還具有分子量小、低免疫原性、高組織滲透性、高穩(wěn)定性等獨特優(yōu)勢。適配體通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進化技術（system?atic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）篩選[4]。細胞SELEX（Cell-SELEX）是以完整活細胞為靶標篩選適配體，Cell-SELEX無需預先確定分子靶標就可篩選出靶向該種細胞的特異性適配體。本研究利用Cell-SELEX技術篩選特異性靶向CRPC細胞的適配體，并應用流式細胞術等一系列實驗，研究所篩選的適配體對CRPC組織細胞的靶向性和親和性，以期為CRPC的早期診斷和靶向治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑人前列腺癌細胞系LNCap（ADPC細胞系）、C4-2（CRPC細胞系）購自中國科學院上海生命科學研究所細胞庫，鏈霉親和素磁珠購自蘇州海貍納米科技有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司，進口胎牛血清購自ZETA LIFE公 司，DNA Marker（DL 2000）購 自TaKaRa公司，其他試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純試劑。

PCR儀（Bio-Rad美國），磁性分離器（西安金磁納米生物技術有限公司），流式細胞儀（BD美國），激光共聚焦熒光顯微鏡（Nikon日本），熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus日本）。1.2 CRPC適配體篩選設計隨機單鏈DNA文庫及上、下游引物，其序列分別如下：DNA文庫TGCG?GCAGTTGAAGCAAGGC(N40)ACGGCAGCACCAGAGAACCA；上 游 引 物5’-TGCGGCAGTT?GAAGCAAGGC-3’；下游引物5’-TGGTTCTCTG?GTGCTGCCGT-3’；上游引物的5’端用FITC標記，下游引物的5’端用生物素標記；DNA文庫和引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，采用固相亞磷酸酰胺合成法，經(jīng)HPLC純化。

分別制備ADPC細胞系LNCap和CRPC細胞系C4-2的細胞懸液，置于超聲破碎儀作用60 min，所得產(chǎn)物作為PCR模板，行PCR擴增。以C4-2細胞基因組作為正篩選的PCR模板，以LNCap細胞基因組作為負篩選的PCR模板，將每一輪次篩選得到的DNA產(chǎn)物為模板進行PCR擴增、純化。用生物素-鏈霉親和素磁珠分離法將PCR產(chǎn)物分離后所獲得的產(chǎn)物用于下一輪次的篩選，共擴增14個循環(huán)。用流式細胞儀監(jiān)測Cell-SELEX篩選進程。

1.3 CRPC適配體的鑒定將最后一輪次篩選所得的DNA產(chǎn)物行PCR擴增純化，PCR產(chǎn)物與pTOPO載體連接，然后轉化至大腸桿菌感受態(tài)DH5a中進行擴增。隨機挑取60個單克隆，分別置于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后行菌液PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸凝膠電泳鑒定。將出現(xiàn)明顯目的條帶的菌液樣品送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行DNA測序。用mfold預測目的DNA及核酸適配體的二級結構。

采用單點吸附測定法獲得適配體的平衡解離常數(shù)。以流式細胞術熒光幾何平均值為縱坐標，以適配體濃度為橫坐標，根據(jù)公式Y=Bmax×X/(Kd+X)方程模擬曲線，分別計算所篩選適配體CRPC-1和CRPC-2的平衡解離常數(shù)。

1.4 檢測篩選出的適配體特異性靶向CRPC細胞的能力

1.4.1流式細胞術常規(guī)培養(yǎng)人前列腺癌細胞系LNCap和C4-2。取對數(shù)生長期的前列腺癌細胞，用胰酶消化，800 r/min離心5 min，棄上清，加入流式洗液重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，胎牛血清封閉30 min，加入200 pmol FITC標記的適配體CRPC-1/CRPC-2溶液，充分重懸細胞，置于冰上孵育30 min，用流式細胞儀檢測各細胞系分別與所篩選適配體的特異性結合情況。

1.4.2細胞免疫熒光檢測同樣取對數(shù)生長期的前列腺癌細胞LNCap和C4-2，分別接種于20 mm激光共聚焦培養(yǎng)皿中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞完全伸展并生長至培養(yǎng)皿底面積約75%時，吸棄上清液，PBS洗滌，向培養(yǎng)皿中加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，50 g/L BSA室溫封閉1 h，用PBS洗滌后加入200 pmol FITC標記的適配體CRPC-1/CRPC-2溶液，置于4℃避光孵育6~8 h，加入DAPI（1∶1 000）孵育5 min襯染細胞核，封片后置于激光共聚焦熒光顯微鏡下，觀察各細胞的熒光顯示比例。

1.5 檢測適配體CRPC-1對CRPC組織特異性結合的能力收集臨床確診的良性前列腺增生、早期前列腺癌及CRPC患者各2例，取各組患者病理組織浸泡于40 g/L多聚甲醛固定后，石蠟包埋組織塊，制作4 μm厚切片。經(jīng)抗原修復后，滴加適量50 g/L BSA完全覆蓋切片組織，室溫封閉1 h，然后滴加標記FITC熒光基團的適配體CRPC-1溶液，4℃避光孵育過夜；加入適量DAPI（1∶1 000）室溫孵育5 min襯染細胞核，封片后置于激光共聚焦熒光顯微鏡下，觀察3種前列腺病理組織的熒光顯示比例。

2 結 果

2.1 CRPC適配體的篩選情況利用Cell-SELEX技術從隨機單鏈DNA文庫中篩選與C4-2細胞特異性結合，而不與LNCap細胞結合的DNA序列，共篩選14輪；對每一輪篩選得到的DNA產(chǎn)物行流式細胞術檢測，觀察DNA產(chǎn)物與靶細胞特異性結合的相對熒光強度與相對細胞計數(shù)的結果顯示，隨著篩選次數(shù)的增加，DNA產(chǎn)物與C4-2細胞結合的熒光強度呈逐漸增強趨勢，而與LNCap細胞結合的熒光強度始終較低；相對熒光強度量化結果顯示熒光強度差異有統(tǒng)計學意義（圖1）。

圖1 CRPC特異性適配體Cell-SELEX的篩選Fig.1 The selection process of CRPC aptamer generation by Cell-SELEX

2.2 CRPC適配體的鑒定結果將經(jīng)過14輪次篩選后所得的DNA產(chǎn)物進行PCR擴增、連接、轉化并隨機挑取60個單克隆行菌液PCR及電泳鑒定，將出現(xiàn)明顯目的條帶的樣本送公司測序，去除未檢出、非單克隆序列、同源性序列，余下序列送上海生工生物工程有限公司合成，最后經(jīng)非變性核酸凝膠電泳鑒定，選取兩條序列作為目的適配體，分別命名為CRPC-1和CRPC-2，其序列及預測的二級結構示意圖如圖2所示。計算所篩選適配體的解離常數(shù)，分別為CRPC-1的解離常數(shù)為（4.9±1.6）nmol/L，CRPC-2的解離常數(shù)為（33.26±4.1）nmol/L（圖3）。

圖2 Cell-SELEX篩選所獲得的核酸適配體CRPC-1（A）和CRPC-2（B）的序列及二級結構示意圖Fig.2 Sequence and secondary structure prediction of aptamer CRPC-1（A）and CRPC-2（B）selected by Cell-SELEX

圖3 Cell-SELEX篩選所獲得的核酸適配體CRPC-1（A）和CRPC-2（B）的的解離常數(shù)Fig.3 Dissociation constants of aptamer CRPC-1（A）and CRPC-2（B）selected by Cell-SELEX

2.3 檢測適配體對CRPC細胞特異性結合的能力

2.3.1流式細胞術檢測結果顯示，F(xiàn)ITC標記的適配體特異性靶向前列腺癌細胞的CRPC-1和CRPC-2均可以與C4-2細胞特異性結合，結合熒光強度較高，而不能結合LNCap細胞；作為對照的隨機DNA文庫，對2種細胞均不能結合；相對熒光強度量化結果顯示，熒光強度組間差異有統(tǒng)計學意義（圖4）。這提示篩選出的兩條適配體對CRPC細胞具有良好的靶向親和性。

2.3.2細胞免疫熒光將FITC標記的適配體CRPC-1和CRPC-2分別與LNCap和C4-2細胞共孵育的激光共聚焦熒光顯微鏡下的觀察結果顯示，C4-2細胞表面可見明顯的熒光標記，而LNCap細胞表面未見特異性熒光顯示（圖5），表明篩選出的2個適配體均能特異性結合CRPC細胞。

圖4流式細胞術檢測核酸適配體CRPC-1、CRPC-2對CRPC細胞的靶向親和性Fig.4 Binding affinity of aptamer CRPC-1 and CRPC-2 to CRPC cell lines detected by flow cytometry

圖5細胞免疫熒光實驗檢測核酸適配體CRPC-1、CRPC-2對CRPC細胞的靶向親和性Fig.5 Binding affinity of aptamer CRPC-1 and CRPC-2 to CRPC cell lines detected by immunofluorescence assay

2.4 檢測適配體CRPC-1對CRPC組織特異性結合的能力對3種前列腺病理組織的免疫熒光染色的分析發(fā)現(xiàn)適配體CRPC-1能使CRPC組織特異性染色，而對良性前列腺增生組織及早期前列腺癌組織染色不明顯（圖6）。提示篩選出的適配體CRPC-1能特異性識別并結合CRPC組織。

3 討 論

最新數(shù)據(jù)表明，前列腺癌居全球男性癌癥發(fā)病率第三位，死亡率第五位，嚴重影響了男性的生命健康[5]。雄激素剝奪治療是目前前列腺癌治療的標準方法，其對于減少腫瘤負荷、降低前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen,PSA）水平具有重要意義[6]。但雄激素剝奪治療不能治愈前列腺癌，多數(shù)進展期前列腺癌最終都會發(fā)展為CRPC[7]。

歐洲泌尿外科協(xié)會將CRPC定義為去勢后血清睪酮水平＜50 ng/dL并且合并三項之一的（生化進展：1周內連續(xù)3次PSA升高并且PSA＞2 ng/mL；或者影像學進展出現(xiàn)新的轉移灶；或者患者癥狀進展惡化[2]）。盡管體外細胞實驗可以明確鑒別激素依賴性與激素非依賴性前列腺癌細胞，但在體內難以實現(xiàn)CRPC的早期發(fā)現(xiàn)與診斷。多數(shù)CRPC患者在確診時已有明顯癥狀或出現(xiàn)生化進展。由于發(fā)現(xiàn)時間晚，這類患者極易產(chǎn)生耐藥性，病情進展快、死亡率高[8-9]。因此，從細胞分子水平早期診斷CRPC對于及時調整臨床用藥、改善前列腺癌患者預后、提高患者生存質量至關重要。

圖6組織免疫熒光實驗檢測核酸適配體CRPC-1的CRPC組織特異性Fig.6 Binding affinity of aptamer CRPC-1 to CRPC tissues detected by immunohistofluorescence assay

腫瘤在進展過程中伴隨的基因或蛋白的變異使得癌變細胞與正常細胞或其他腫瘤細胞之間存在分子水平上的差異，這些差異正是SELEX技術篩選適配體的分子基礎。傳統(tǒng)的SELEX需要預先選定相應靶標才能進一步行適配體篩選，而Cell-SELEX不需要準確了解細胞表面的分子及其結構信息，可以在未知標志物的情況下用完整的活細胞作為靶標獲取高特異性、高親和性的適配體[4,10]。因此，Cell-SELEX技術在疾病的早期診斷和靶向治療中極具應用前景。目前，國內外已有學者利用Cell-SELEX成功篩選出源于肝細胞癌、小細胞肺癌以及結直腸癌細胞的適配體[11-15]，為后續(xù)相關腫瘤特異性診療方案的研究奠定了實驗基礎。

當前，尚未見CRPC特異性分子靶點的報道，以CRPC特異性分子為靶點篩選CRPC適配體的方法難以實現(xiàn)。本課題利用Cell-SELEX技術，以激素非依賴性前列腺癌細胞C4-2為靶細胞，以其同源激素依賴性前列腺癌細胞LNCap為負篩細胞，從隨機單鏈DNA文庫中篩選出可特異性結合CRPC細胞而不結合ADPC細胞的適配體，即特異性靶向CRPC細胞的適配體CRPC-1和CRPC-2，并經(jīng)一系列實驗研究證實CRPC-1和CRPC-2均能特異性結合CRPC組織細胞，而不與ADPC組織細胞結合。本研究證實這兩種適配體對CRPC組織細胞具有良好的靶向性和親和性，有望在分子細胞學水平將ADPC與CRPC相鑒別，進而早期識別CRPC狀態(tài)，并為早期篩查CRPC提供了新思路和理論依據(jù)，為CRPC的早期診斷和靶向治療提供新方法，對及時調整前列腺癌治療方案、延緩腫瘤進展速度、改善患者預后具有重要意義。