李成 王錫蘭 姚東校 徐彬

(1海南省食品藥品檢驗(yàn)所三亞分所海南三亞572000;2海南省食品檢驗(yàn)檢測中心海南?？?70301)

氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考屬于氯霉素類藥物，是一種廣譜抗生素，對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有抑制作用［1］，由于氯霉素對人體危害較大［2-3］，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號公告［4］已將氯霉素列在動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單中。甲砜霉素和氟苯尼考在GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》［5］中也規(guī)定了最大殘留限量值。金剛烷胺和金剛乙胺同屬抗病毒類藥物，主要用于流感的預(yù)防和早期的治療，但是大量的殘留會對機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)造成較大的危害［6］，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已于2005年發(fā)布第560號公告禁止金剛烷胺和金剛乙胺獸用［7］。恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等喹諾酮類藥物具有廣譜高效、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于動物疾病治療、預(yù)防及促生長方面，但長期不規(guī)范使用會產(chǎn)生藥物殘留和細(xì)菌耐藥性問題［8］。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第2292號公告規(guī)定，在食品動物中停止使用培氟沙星和氧氟沙星，GB 31650—2019也對恩諾沙星在動物性食品中殘留限量進(jìn)行了明確規(guī)定。雞蛋和雞肉作為動物源食品的重要組成部分，含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白，深受大眾喜愛，雞肉和雞蛋食用安全的重要性不言而喻。但是目前國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對動物源食品中獸藥殘留的檢測多適用于雞肉基質(zhì)，而且同時(shí)檢測雞肉和雞蛋中氯霉素類、抗病毒類和喹諾酮類獸藥殘留的研究較少，因此建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法同時(shí)檢測雞肉和雞蛋中多獸藥殘留對雞肉和雞蛋類食品的食用安全性以及對其日常的監(jiān)管具有重要意義。

獸藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法［9］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［10-11］、液相色譜法［12］、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［13-16］等，其中超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是目前最為常用的方法。現(xiàn)有方法普遍存在問題是大多前處理需要對樣品進(jìn)行液-液萃取、固相萃取柱凈化，部分方法需要進(jìn)行衍生化，過程繁瑣操作復(fù)雜、耗時(shí)長而且會消耗大量有機(jī)試劑，不適合大通量樣品篩查。本研究采用Waters PRIME HLB固相萃取柱凈化，無需活化平衡，前處理過程簡單，試劑消耗量小，省時(shí)省力，經(jīng)濟(jì)節(jié)約。既保證了檢驗(yàn)的準(zhǔn)確度，又提高了工作效率。

本研究選取了日常檢測中風(fēng)險(xiǎn)較高的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等9種藥物，建立一種適合雞肉和雞蛋中多獸藥殘留同時(shí)分析的檢測方法，以期為食品安全監(jiān)測提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備

LC-30AD超高效液相色譜儀（日本島津公司）；QTRAP 5500三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX公司）；Multi Reax全能型振蕩器（德國Heidolph公司）；KQ5200E超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；3-30KS離心機(jī)（德國Sigma公司）；MTN-2800W氮吹儀（天津奧特賽恩儀器有限公司）；XS 204電子分析天平（瑞士Mettler-To‐ledo公司）；Milli-Q超純水制備系統(tǒng)（德國默克公司）。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品

氯霉素（1 000 μg/mL）、氯霉素-D5（100 μg/mL）、甲砜霉素（100 μg/mL）、氟苯尼考（1 000 μg/mL）、金剛烷胺（100 μg/mL）、金剛乙胺（100 μg/mL）、恩諾沙星（100 μg/mL）、環(huán)丙沙星（1 000 μg/mL）、氧氟沙星（1 000 μg/mL）、諾氟沙星（100 μg/mL）（阿 爾 塔公司）。

1.1.3 試劑耗材

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、乙酸銨（色譜純，美國ThermoFisher Scientific公司）；甲酸（色譜純，上海aladdin公司）；Waters Oasis PRIME HLB固 相 萃 取 柱（200 mg/6 mL，美 國Waters公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg/mL）：分別準(zhǔn)確吸取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品適量于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，置于-20℃冰箱中保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（1 μg/mL）：準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.5 mL于5 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，置于-20℃冰箱中保存。

同位素內(nèi)標(biāo)中間液（1 μg/mL）：準(zhǔn)確吸取氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，置于-20℃冰箱中保存。

同位素內(nèi)標(biāo)工作液（100 ng/mL）：準(zhǔn)確吸取同位素內(nèi)標(biāo)中間液1 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，置于-20℃冰箱中保存。

1.2.2 樣品處理

稱取經(jīng)均質(zhì)樣品2 g（精確到0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入100 μL同位素內(nèi)標(biāo)工作液和10 mL含0.2%甲酸的80%乙腈水（V∶V）溶液，漩渦混勻2 min，置于超聲波清洗器中超聲提取10 min，9 000 r/min離心5 min。無需活化平衡，將全部提取液加載到PRIME HLB固相萃取柱，樣液在重力作用下過柱，收集全部流出液。在40°C下氮?dú)獯抵两?，用?.1%甲酸的乙腈水（10∶90，V∶V）溶解定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，上LC-MS/MS測定。

1.2.3 儀器分析條件

1.2.3.1 液相色譜條件

Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），美國Waters公司；柱溫：40°C；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL。流動相A：0.1%甲酸水；流動相B：乙腈。梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相洗脫梯度

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI）；電噴霧電壓（ESI-）：-4 500 V；電噴霧電壓（ESI+）：5 500 V；離子源溫度：550°C；霧化氣（GS1）：55 psi；加熱氣（GS2）：55 psi；氣簾氣（CUR）：30 psi；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。其它質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

本研究選取Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）和Agilent XDB C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）等3種不同型號色譜柱進(jìn)行分離研究。結(jié)果表明，在同等色譜條件下，9種化合物在Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱上的色譜峰形最好，分離度最佳。因此選擇Waters Acquity UPLC BEH C18柱進(jìn)行測定。

2.1.2 流動相的選擇

為了提高化合物的離子化效率，提高響應(yīng)值以及改善化合物峰形，本研究比較了水/甲醇、水/乙腈、0.1%甲酸水/乙腈、5 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）/乙腈等流動相體系對目標(biāo)化合物的影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動相為水/甲醇或水/乙腈時(shí)部分目標(biāo)物峰展寬，響應(yīng)值相對較低；流動相加入甲酸后，增加了目標(biāo)化合物的電離效率，響應(yīng)值普遍增大；流動相加入乙酸銨后部分化合物峰形得到改善，但有部分化合物響應(yīng)值降低，綜合考慮選取0.1%甲酸水/乙腈為流動相。通過優(yōu)化流動相梯度洗脫程序，9種目標(biāo)化合物達(dá)到較好分離，色譜峰峰型良好。各目標(biāo)化合物定量離子對提取質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 九種獸藥定量離子對提取質(zhì)譜圖

2.2 樣品處理的優(yōu)化

2.2.1 提取溶液的選擇

雞肉和雞蛋中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪及磷脂類［16-17］，干擾目標(biāo)化合物的分析，因此需要選擇合適的提取試劑以達(dá)到既能排除干擾，又能充分提取目標(biāo)化合物的目的。本研究首先比較了甲醇、乙腈和乙酸乙酯對雞肉基質(zhì)的提取效果。研究表明，用甲醇提取回收率較低，乙酸乙酯提取基質(zhì)干擾較大，用乙腈提取沉淀蛋白的效果好，回收率高且重復(fù)性較好。用同樣的方法對雞蛋進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)乙腈的提取效果最好，因此選擇乙腈作為提取液進(jìn)行進(jìn)一步研究。試驗(yàn)分別比較了70%、80%、90%乙腈水溶液及純乙腈溶液的提取效率和凈化效果，同時(shí)根據(jù)李明［18］、劉新輝［19］等研究比較了加入0.2%甲酸對提取效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%乙腈水溶液提取時(shí)提取液渾濁，過PRIME HLB固相萃取柱困難且回收率低，90%乙腈水溶液和純乙腈提取時(shí)部分化合物基質(zhì)干擾影響較大，80%乙腈水溶液提取基質(zhì)干擾較小，回收率較高。加入甲酸后提取效率普遍增高，含0.2%甲酸的80%乙腈水（V∶V）溶液能同時(shí)兼顧9種不同化合物的提取效率。以雞肉中金剛烷胺為例，見圖2。

圖2 不同提取溶劑對雞肉中金剛烷胺的影響

續(xù)圖1九種獸藥定量離子對提取質(zhì)譜圖

2.2.2 固相萃取柱的選擇

本研究比較了HLB柱、MCX柱和PRIME HLB柱的凈化效果。按照1.2.2進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，采用上述3種凈化柱凈化。對比發(fā)現(xiàn)經(jīng)HLB柱和MCX柱凈化后樣品的回收偏低，平行樣品間相對偏差較大。經(jīng)PRIME HLB柱凈化后樣品基質(zhì)干擾較小，9種化合物回收率高且穩(wěn)定，而且PRIME HLB柱是一種雜質(zhì)吸附型固相萃取柱，能有效去除雞蛋和雞肉中脂肪和磷脂［20］，無需活化平衡，操作簡便，減少有機(jī)試劑的使用，綜合考慮選擇PRIME HLB柱作為凈化柱。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

用按照1.2.2處理得到的陰性樣品處理液，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1、5、10、20、50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，同位素內(nèi)標(biāo)濃度為10 ng/mL進(jìn)行上機(jī)測定。以目標(biāo)化合物濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。9種目標(biāo)化合物均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.997，見表3。按照信噪比的3倍（S/N＝3）和10倍（S/N＝10）分別對應(yīng)目標(biāo)化合物濃度作為檢出限和定量限的規(guī)則，9種目標(biāo)化合物的檢出限為0.05 μg/kg，定 量 限 為0.5 μg/kg，低 于GB/T 20756—2006［21］、GB/T 20366—2006［22］等 國家 標(biāo)準(zhǔn)檢出限和定量限的要求。

表3 九種目標(biāo)化合物的線性關(guān)系、檢出限、定量限

2.4 回收率和精密度

分別在陰性樣品中添加低、中、高3個(gè)濃度水平的9種混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，每個(gè)水平做6個(gè)平行樣，根據(jù)1.2.2方法進(jìn)行前處理，平均回收率為74.6%～119.1%，RSD范圍為0.9%～7.6%，見表4，說明本方法回收率及精密度較好。

表4 九種目標(biāo)化合物的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.5 實(shí)際樣品檢測

采用上述方法檢測本市農(nóng)貿(mào)市場隨機(jī)抽取的5份雞肉樣品和20份雞蛋樣品。其中一份雞蛋樣品檢測出恩諾沙星，檢測值為7.7 μg/kg，其余樣品均未檢測出上述9種藥物。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定雞肉和雞蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和諾氟沙星等獸藥殘留量的方法。優(yōu)化了色譜條件、質(zhì)譜條件、樣品前處理方法和樣品凈化方式。本方法檢出限低，回收率高、精密度好，為同時(shí)檢測雞肉和雞蛋中多獸藥殘留提供了一種便捷可靠的方法，能夠滿足檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)日常樣品篩查和研究的需要。