王少薇，楊鈺萌，解昕軼，李俊杰，張榮強(qiáng)

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，陜西咸陽 712046）

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染所致，可通過呼吸道飛沫和氣溶膠途徑傳播，人群普遍易感，傳播速度較快[1]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19傳播途徑較多，疫情有可能會(huì)發(fā)生第二次的暴發(fā)，因此抗擊新冠疫情并未取得全面勝利，仍需嚴(yán)防。

臨床實(shí)踐表明,COVID-19重型患者多在發(fā)病1周后，因病毒侵入人體肺上皮細(xì)胞，出現(xiàn)胸悶、呼吸困難等癥狀，甚至進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征。另有研究表明，SARS-CoV-2感染肺泡上皮2型細(xì)胞(AT2s)，導(dǎo)致肺損傷和氣體交換障礙[2]。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19患者肺部主要為彌漫性肺損傷(diffuse alveolar damage,DAD)，且僅在肺部發(fā)現(xiàn)了SARS-CoV-2核酸陽性[3]。由此表明，SARS-CoV-2在侵入人體后，最易并持續(xù)損害肺組織上皮細(xì)胞，保護(hù)COVID-19患者的肺組織是首要任務(wù)。但目前對(duì)于SARS-CoV-2侵及肺組織的致病機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)行更加深入的研究。因此，大數(shù)據(jù)背景下針對(duì)SARS-CoV-2最先侵入的肺上皮細(xì)胞中差異表達(dá)基因的基因組學(xué)研究具有重要意義。

本研究采用GEO公共數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)的數(shù)據(jù)集GSE160435，篩選肺上皮細(xì)胞感染SARS-CoV-2的差異表達(dá)基因，通過富集分析詮釋其生物學(xué)功能，利用Network Analyst在線軟件建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interactions network,PPI)等，探討SARS-CoV-2感染對(duì)肺上皮細(xì)胞的潛在影響機(jī)制，為制定預(yù)防、診斷和治療措施提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源以“COVID-19”為關(guān)鍵詞檢索GEO Datasets公共數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得由Yao、Mulay和Stripp提交更新的數(shù)據(jù)集GSE160435。該數(shù)據(jù)集由GPL24676 Illumina NovaSeq 6000(Homo sapiens)和GPL29320 Illumina NovaSeq 6000(Homo sapiens;severe acute respiratory)兩個(gè)平臺(tái)檢測(cè)，共檢測(cè)60 663個(gè)基因，包含10個(gè)樣本，分別為COVID感染組（n=5）和MOCK對(duì)照組（n=5）。

1.2 樣品處理首先將SARS-CoV-2轉(zhuǎn)染從原代肺AT2細(xì)胞產(chǎn)生的類肺上皮細(xì)胞，然后使用氯仿-異丙醇乙醇法提取轉(zhuǎn)染后的肺上皮細(xì)胞和Mock對(duì)照組肺上皮細(xì)胞的總RNA，隨后進(jìn)行基因文庫構(gòu)建，測(cè)序后獲得數(shù)據(jù)集GSE160435。

1.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理將下載的數(shù)據(jù)集GSE160435上傳至Network Analyst在線軟件(http://www.networ?kanalyst.ca/)，刪除錯(cuò)誤值或可疑值；隨后采用Log2CPM(Log2-counts per million)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，確保后續(xù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

1.4 差異表達(dá)基因的篩選將預(yù)處理后的數(shù)據(jù)利用Limma法，以AdjustedP＜0.05,Log2Fold Change＞2為參數(shù)進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，篩選SARS-CoV-2感染人肺上皮細(xì)胞后差異表達(dá)基因(differential ex?pression genes,DEGs)。

1.5 基因功能(GO)和信號(hào)通路(KEGG)富集分析把篩選后的DEGs上傳至在線軟件STRING(https://string-db.org/)，調(diào)節(jié)信度(Confidence)至0.7，進(jìn)行GO富集分析，包括生物學(xué)過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細(xì)胞學(xué)組分(cellular component,CC)，同時(shí)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析。

1.6 PPI Network的建立與分析利用STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)DEGs建立PPI網(wǎng)絡(luò)，為了獲得核心PPI網(wǎng)絡(luò)，首先選擇Minimum Network，然后將Between?ness Filter調(diào)節(jié)為50，獲取最終的PPI網(wǎng)絡(luò)。最后采用Cytoscape(www.cytoscape.org/3.7.2)對(duì)其進(jìn)行可視化，獲得PPI交互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.7肺組織特異性DEGs之PPI交互作用分析本研究進(jìn)一步選用數(shù)據(jù)庫TCSBN Database建立肺組織特異性DEGs的PPI交互網(wǎng)絡(luò)，可視化后獲得肺組織特異性的DEGs蛋白交互網(wǎng)絡(luò)。

1.8 MicroRNA-DEG交互作用分析上傳DEGs至Network Analyst中，采用儲(chǔ)存庫RegNetwork Repository建 立MicroRNA-DEG交 互 作用網(wǎng)絡(luò)；調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)參數(shù)后，獲得其核心網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape進(jìn)行可視化。

1.9 轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)-DEG交互作用分析本研究利用Network Analyst和ENCODE數(shù)據(jù)庫，適宜調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)參數(shù)，建立TF-DEG調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析TF對(duì)DEGs的調(diào)控作用。

1.10 環(huán)境化學(xué)物對(duì)DEG的調(diào)節(jié)作用分析本研究采用CTD(Comparative Toxicogenomics Database)數(shù)據(jù)庫探索環(huán)境化學(xué)物對(duì)DEGs的調(diào)節(jié)作用，采用Cytoscape進(jìn)行可視化，建立Chemicals-DEG調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)的預(yù)處理將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，各樣本基因表達(dá)數(shù)據(jù)均數(shù)基本穩(wěn)定，分布密度基本一致，顯示數(shù)據(jù)質(zhì)量良好、可靠，可進(jìn)行下一步分析（圖1）。

圖1數(shù)據(jù)預(yù)處理前各樣本基因表達(dá)數(shù)據(jù)的箱式圖(A)和分布密度曲線(C)；數(shù)據(jù)預(yù)處理后各樣本基因表達(dá)數(shù)據(jù)的箱式圖(B)和分布密度曲線（D）Fig.1 Box plots(A)and distribution density curves(C)of gene expression data of each sample before data preprocess?ing;Box plots(B)and distribution density curves(D)of gene expression data of each sample after data preprocessing

2.2 差異表達(dá)基因的篩選篩選共發(fā)現(xiàn)324個(gè)DEGs，其 中 上 調(diào)112個(gè)（34.57%），下 調(diào)212個(gè)（65.43%）。前20位差異表達(dá)基因信息見表1。DEGs分析的火山圖見圖2A，上調(diào)和下調(diào)最明顯的6個(gè)基因在COVID組和MOCK組的表達(dá)情況見圖2中B~G。

圖2 差異表達(dá)基因的火山圖(A)及前6個(gè)基因的表達(dá)變化(B~G)Fig.2 Volcanic plot of DEGs(A)and expression of the top 6 DEGs(B-G)

表1 前20位差異表達(dá)基因信息Tab.1 Details of the top 20 DEGs

2.3 KEGG信號(hào)通路富集分析富集分析結(jié)果顯示，DEGs主要參與：病毒相關(guān)的防御反應(yīng)等生物學(xué)過程；發(fā)揮與信號(hào)受體結(jié)合等分子功能；參與組成細(xì)胞外圍、胞外間隙、細(xì)胞外基質(zhì)等；主要涉及蛋白質(zhì)消化與吸收、甲型流感、人乳頭瘤病毒感染、丙型肝炎、視黃醇代謝及ECM-受體相互作用等信號(hào)通路（表2，圖3）。

表2 Top 10 KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果Tab.2 KEGG signaling pathway enrichment results of differentially expressed genes

2.4 DEGs解碼蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)DEGs的 解 碼 蛋 白PPI網(wǎng)絡(luò)由36節(jié)點(diǎn)組成，上調(diào)蛋白6個(gè)，下調(diào)蛋白11個(gè)，預(yù)測(cè)蛋白19個(gè)（圖4A）；肺組織特異性PPI網(wǎng)絡(luò)由42節(jié)點(diǎn)組成，上調(diào)蛋白8個(gè)，下調(diào)蛋白12個(gè)，預(yù)測(cè)蛋白19個(gè)（圖4B）。綜合分析可知，其中PDGFRB和KIT（Degree cutoff＞5）與其他蛋白的相互作用密切，若刪除這兩個(gè)蛋白，整個(gè)網(wǎng)絡(luò)不僅穩(wěn)定性降低，并且變得散亂。因此，PDGFRB和KIT為PPI網(wǎng)絡(luò)的重要核心節(jié)點(diǎn)。

圖4 DEGs相關(guān)PPI網(wǎng)絡(luò)（紅色代表上調(diào)基因，藍(lán)色代表下調(diào)基因，綠色代表與DEGs有交互作用的預(yù)測(cè)基因）Fig.4 DEGs-related PPI network(Red represents up-regulated genes,blue represents down-regulated genes,and green represents predicted genes that interact with DEGs）

圖3差異表達(dá)基因的Top 10 GO富集分析結(jié)果Fig.3 Top10 GO enrichment analysis results of differentially expressed genes

2.5 microRNA-DEG交互作用分析根據(jù)microRNADEG交互作用網(wǎng)絡(luò)顯示，有9個(gè)microRNA與DEGs之間存在著交互作用，其中hsa-miR-340與9個(gè)DEGs存 在 靶 向作用關(guān) 系，has-miR-9與8個(gè)DEGs存在靶向作用關(guān)系；BNC2與7個(gè)microRNA存在靶向作用關(guān)系，SGCD與6個(gè)microRNA存在靶向作用關(guān)系（圖5）。

圖5 microRNA-DEG調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(紅色代表上調(diào)基因，藍(lán)色代表下調(diào)基因，黃色代表microRNA，綠色代表與DEGs有交互作用的預(yù)測(cè)基因)Fig.5 microRNA-DEG regulatory network(Red represents up-regulated genes,blue represents down-regulated genes,and yellow represents microRNA,green represents predicted genes that interact with DEGs)

2.6 TF-DEG交互作用分析TF對(duì)DEGs調(diào)控作用分析結(jié)果顯示，19個(gè)DEGs受14種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。其中轉(zhuǎn)錄因子ZBTB7A對(duì)13個(gè)DEGs有調(diào)節(jié)作用，EZH2、SIN3A和KLF9對(duì)12個(gè)DEGs有 調(diào) 節(jié) 作用；HOXB4、ISG15受10個(gè)TF的調(diào)控（圖6）。

圖6 TF-DEG調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(紅色代表上調(diào)基因，藍(lán)色代表下調(diào)基因，綠色代表與DEGs有交互作用的TF)Fig.6 TF-DEG regulation network(Red represents up-regu?lated genes,blue represents down-regulated genes,and green represents TF that interact with DEGs)

2.7 環(huán)境化學(xué)物對(duì)DEG調(diào)控作用分析Chemicals-DEG調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示：鎳（nickel）、雌二醇（estradiol）、丙戊酸（valproic acid）等16種環(huán)境化學(xué)物對(duì)14個(gè)DEGs產(chǎn)生著特異的影響與調(diào)控作用，其中雌二醇、丙戊酸對(duì)14個(gè)DEGs均 產(chǎn)生影響；TNFRSF12 A可受曲 古菌素A（trichostatin A）、維甲酸（retinoic acid）、環(huán)孢素（cyclosporine）等15種環(huán)境化學(xué)物的影響；ANXA3、ISG15和IFI6可受維甲酸、環(huán)孢素、雌二醇等14種化學(xué)物的影響（圖7）。

圖7 環(huán)境化學(xué)物-DEG調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(紅色代表上調(diào)基因，藍(lán)色代表下調(diào)基因，綠色代表與DEGs有交互作用的化學(xué)物)Fig.7 Environment chemical-DEG regulation network(Red represents up-regulated genes,blue represents down-regu?lated genes,and green represents chemicals that interact with DEGs)

3 討 論

在COVID-19疫情下如何有效應(yīng)對(duì)成為世界各國首要的任務(wù)之一和研究熱點(diǎn)與難點(diǎn)。本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)基于肺上皮細(xì)胞的測(cè)序數(shù)據(jù)，進(jìn)行深入探索和分析，篩選出肺上皮細(xì)胞感染SARS-CoV-2后的差異表達(dá)基因324個(gè)，以MMP9基因上調(diào)、PLP?PR4基因下調(diào)最為明顯。MMP9的主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matris,ECM)的動(dòng)態(tài)平衡，分解呼吸道和肺內(nèi)的結(jié)構(gòu)復(fù)合物如ECM和基底膜。MMP9表達(dá)過度，能直接影響ECM降解作用、組織重塑和炎癥反應(yīng)[4]。本研究結(jié)果提示，CXCL11參與急性肺功能損害的發(fā)病過程，其表達(dá)與矽肺纖維化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，PLPPR4的主要功能是催化許多生物活性脂質(zhì)介質(zhì)的脫磷化，調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能。LIU等[7]研究發(fā)現(xiàn)，PRELP是一種能提高中性粒細(xì)胞的吞噬殺傷活性從而防止細(xì)菌黏附到肺上皮細(xì)胞的新型天然免疫抗菌成分。目前雖然尚無針對(duì)MMP9、CXCL11、PLPPR4和PRELP參與肺組織上皮細(xì)胞的抗病毒免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究報(bào)道，本研究的探索發(fā)現(xiàn)為后續(xù)的研究提供了參考。

富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DEGs主要參與組成胞外間隙、細(xì)胞外基質(zhì)等細(xì)胞成分，誘導(dǎo)對(duì)病毒相關(guān)的防御反應(yīng)，并涉及了甲型流感、ECM-受體相關(guān)的信號(hào)通路。以上結(jié)果提示，SARS-CoV-2感染可能首先對(duì)肺上皮細(xì)胞的外基質(zhì)產(chǎn)生一定的破壞作用而影響肺部的正常功能。PPI的分析發(fā)現(xiàn)，PDGFRB和KIT是網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成員。PDGFRB中文名稱為血小板源性生長(zhǎng)因子受體-β，其在人體中發(fā)揮的主要作用是刺激成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。KIT的主要功能是抑制細(xì)胞凋亡。由此推測(cè)，PDGFRB和KIT可能在抑制肺上皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)其增殖方面發(fā)揮作用。

microRNA是一類內(nèi)源性RNA小分子，能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，主要作為基因表達(dá)的負(fù)性調(diào)控因 子[8]，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-340對(duì)9個(gè)DEGs發(fā)揮了 一定的調(diào)節(jié)作用。趙連忠等[9]研究表明，在甲型流感和其他RNA病毒感染后，hsa-miR-340被降低調(diào)節(jié)，意味著宿主細(xì)胞消耗hsa-miR-340是抗病毒防御的重要內(nèi)容。張博威等[10]還發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-340表達(dá)使T24細(xì)胞的凋亡顯著增加。劉榮鳳等[11]研究提示，hsa-miR-9通過靶向調(diào)控ZEB2從而抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。以上結(jié)果提示，microRNA在病毒侵入人體后通過發(fā)揮一定的生物學(xué)功能參與機(jī)體的免疫過程，但本研究篩選出的microRNA與被SARS-CoV-2感染的肺組織上皮細(xì)胞之間的研究涉及較少，在后續(xù)的研究中仍需進(jìn)一步探討。

TF對(duì)基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。本研究發(fā) 現(xiàn)，ZBTB7A、EZH2、SIN3A和KLF9與DEGs之間交互作用復(fù)雜，關(guān)系密切。GENG等[12]證明，ZBTB7A在UCC中明顯降低調(diào)節(jié)作用，在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞滲透方面起著至關(guān)重要的作用。REDONDO等[13]發(fā)現(xiàn)，ZBTB7A可激活或抑制特定細(xì)胞系分化所需的代謝程序，并控制關(guān)鍵通路。EZH2通過抑制染色質(zhì)中的靶基因促進(jìn)細(xì)胞增殖、凋亡和衰老，在細(xì)胞周期、有絲分裂和DNA修復(fù)中發(fā)揮重要作用，在免疫細(xì)胞（T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）中起決定性作用[14-16]。SIN3A是指導(dǎo)細(xì)胞分化、存活和功能的旁同源轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)節(jié)因子[17]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，鎳、雌二醇、丙戊酸、曲古菌素A、維甲酸、環(huán)孢素等對(duì)DEGs可產(chǎn)生影響。已有研究表明，曲古霉素A影響線粒體凋亡信號(hào)和細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控通路相關(guān)因素的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18-19]。含有游離二氧化硅（Silicon Dioxide）的粉塵進(jìn)入人的肺部后，引起肺巨噬細(xì)胞壞死，導(dǎo)致肺組織纖維化，影響肺的呼吸活動(dòng)。維甲酸主要影響骨的生長(zhǎng)和促進(jìn)上皮細(xì)胞增生、分化、角質(zhì)溶解等代謝作用。DEY[20]研究發(fā)現(xiàn)，Tretinoin作為潛在的SARS-CoV-2 E蛋白離子通道阻滯劑和病毒組裝抑制劑的可能性，這可能是治療冠狀病毒的重要治療策略。GáLVEZ等[21]認(rèn)為，對(duì)于COVID-19患者，環(huán)孢素A（Cyclosporine-A)可作為類固醇治療的輔助治療可改善預(yù)后和降低死亡率，主要適用于中、重度患者。以上的研究結(jié)果提示，環(huán)境化學(xué)物對(duì)人體肺組織上皮細(xì)胞的影響有利有弊，趨利避害有利于改善COV?ID-19患者的療效。本研究結(jié)果與上述研究證據(jù)基本一致，并為上述證據(jù)補(bǔ)充了一定的分子水平依據(jù)。

綜上所述，COVID-19患者肺組織上皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜發(fā)生了顯著變化。PDGFRB、KIT、MMP9等蛋白或基因可能在肺組織的防御免疫機(jī)制中發(fā)揮著重要作用；鎳、雌二醇和維甲酸等可能影響肺上皮細(xì)胞的正常生理功能和病理反應(yīng)。本研究為SARSCoV-2對(duì)肺上皮細(xì)胞致病機(jī)制的研究和制定預(yù)防、診斷和治療措施提供了新的思路。