龍麗, 萬雪超, 楊曉琴

(1.銅仁市人民醫(yī)院 檢驗科, 貴州 銅仁 554300； 2.銅仁市人民醫(yī)院 產(chǎn)科, 貴州 銅仁 554300)

地中海貧血(thalassemia)一組由于珠蛋白基因突變導(dǎo)致某一種珠蛋白肽鏈缺乏或合成不足所引起的遺傳性溶血性貧血病。由Lee和Cooley于1925年在地中海國家意大利人后裔中首次發(fā)現(xiàn)，故稱地中海貧血，亦稱海洋性貧血[1]。該病遍布全世界，但高發(fā)于地中海沿岸國家、中非洲、亞洲、南太平洋地區(qū)等。在我國長江以南也為地中海貧血的高發(fā)區(qū)，但以廣西、廣東、海南、貴州、四川、等省區(qū)多見。地中海貧血分為 α 型、β型、δ β 型和 δ 型4種，其中以 β 和 α 地中海貧血較為常見。貴州省銅仁市為少數(shù)民族聚居地區(qū)，目前還未有人對本市各族育齡婦女的地中海貧血分布情況進行研究分析，本研究擬采用基因診斷方法[2-6]對本地育齡婦女的 α -地中海貧血基因和β -地中海貧血基因進行檢測分析，以了解本地育齡婦女地中海貧血基因攜帶率及基因類型的分布情況。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年8月—2020年12月進行地中海貧血基因檢查的漢族、土家族、苗族、侗族育齡婦女6 586例為研究對象(研究對象的基本信息由產(chǎn)前診斷醫(yī)師協(xié)助完成，均為貴州省銅仁市人)，年齡17～45歲，平均年齡(27±4.25)歲。所有受檢者均抽取靜脈血2～3 mL采血前均進行相關(guān)告知并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1血液標本采集 采集研究對象孕前或孕早期育齡婦女外周血2～3 mL，加入乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝的采血管，4 ℃冰箱保存血樣。

1.2.2血液基因組DNA提取 DNA提取試劑盒使用廣東凱普科技生物有限公司提供的離心柱提取試劑盒。具體提取操作步驟按照廠商提供的說明書進行。

1.2.3PCR擴增 核酸擴增試劑由廣東凱普科技生物有限公司提供的，該試劑盒可檢出3種常見α缺失、3種常見α突變及17種常見β突變。反應(yīng)擴增程序為95 ℃ 15 min，97 ℃變性50 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.4擴增產(chǎn)物雜交 PCR產(chǎn)物95 ℃變性10 min，立即浸入冰水混合物中冰浴3 min。鋪好雜交膜條，預(yù)雜交45 ℃ 2 min，棄雜交液。42 ℃條件下雜交30 min，將雜交液重新放入水浴鍋中。雜交30 min后，開泵進行導(dǎo)流雜交，將雜交膜上的溶液排凈，關(guān)泵。從水浴鍋中取出預(yù)熱到42 ℃的洗脫液1溶液，吸取0.8 mL沖洗膜，加完后停留5 s，開泵將雜交膜上的溶液排凈，關(guān)泵；此步驟重復(fù)4次；加入封阻液封阻，加酶標液0.5 mL，溶液A清洗4次，加顯色液0.5 mL顯色6 min；加雜交液0.8 mL，清洗3次；加蒸餾水清洗晾干。

1.2.5結(jié)果判讀 雜交試劑盒共檢測17種 β -地中海貧血基因 ：41-42M、71-72M、17M、43M、IntM、14-15M、Ivs1-1M、27-28M、31M、654M、-28M、-29M、βeM、Ivs1-5M、CapM、-30M、-32M。6種 α -地中海貧血基因：SEA 、α 3.7、α 4.2、CSM、QSM、WSM。對該試劑盒未檢出的懷疑罕見地中海貧血基因的樣本送至廣州凱普生物有限公司作進一步測序檢查。

1.3 觀察指標

計算育齡婦女人群的 α -地中海貧血基因攜帶率與 β -地中海貧血基因攜帶率，比較該人群漢族、土家族、苗族、侗族育齡婦女地中海貧血基因類型分布。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件，對檢測結(jié)果的不同分組進行差異性分析。計數(shù)資料比較用率(%)表示，用χ2檢驗進行統(tǒng)計分析。P<0.05表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 地中海貧血基因基因突變及缺失位點分布

本次研究檢出地中海貧血基因攜帶者680例，攜帶率為10.32%；其中 α -地中海貧血基因攜帶者336例(攜帶率為5.10%)、β -地中海貧血基因攜帶者323例(攜帶率為4.90%)、混合地中海貧血攜帶者21例(攜帶率為0.32%)。

2.1.1α -地中海貧血 檢出的336例 α -地中海貧血基因攜帶者中東南亞型缺失(--SEA/α α)雜合子133例(占比39.58%)、右側(cè)缺失型(-α3.7/α α)雜合子134例(占比39.88%)，是本地區(qū)的α地中海貧血主要類型(表1和圖1)。

表1 α-地中海貧血各基因突變類型及分布

正常個體 --SEA/αα雜合子 -α3.7/αα雜合子 -α4.2/αα雜合子

2.1.2β -地中海貧血 檢出的323例β-地中海貧血基因攜帶者中17M雜合子122例(占比37.77%)、41-42M雜合子135例(占比41.79%%)，是本地區(qū)的主要β地中海貧血類型(表2和圖2)。

41-42M雜合子 17M雜合子 43M雜合子 654M雜合子

表2 β-地中海貧血各基因突變類型及比例

2.1.3罕見地中海貧血 檢測結(jié)果與臨床診斷不符的樣本進行基因測序分析，本研究中共檢出罕見地中海貧血2例，測序結(jié)果見圖3。

注：A為341T>A突變，箭頭所示為β基因編碼區(qū)序列的341號堿基T突變?yōu)锳，B為170G>A突變，箭頭所示為β基因編碼區(qū)序列的170號堿基G突變?yōu)锳。

2.2 α-β 復(fù)合地中海貧血

本次研究共檢測到 α-β 復(fù)合地中海貧血 21例，復(fù)合型地中海貧血基因型分布以-α3.7/αα與41-42M復(fù)合型和--SEA/αα與41-42M復(fù)合型占比最高，達33.33%和23.81%，見表3和圖4。

654M復(fù)合α3.7缺失雜合子 41-42M復(fù)合α3.7缺失雜合子

表3 α-β 復(fù)合型地中海貧血類型

2.3 各民族育齡婦女地中海貧血基因類型分布

本次研究中對6 586例育齡婦女進行地中海貧血基因檢測，漢族育齡婦女共檢出地中海貧血314例，其中土家族152例、苗族141例及侗族73例，各民族間攜帶率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.454，P=0.075)。見表4。

表4 各族育齡婦女地中海貧血基因攜帶情況

3 討論

地中海貧血是一種單基因遺傳病，是由于合成珠蛋白的基因缺陷致使血紅蛋白中的珠蛋白肽鏈有一種或幾種合成減少或者不能合成、導(dǎo)致血紅蛋白的組分發(fā)生改變的常染色體隱性遺傳病[7]。在臨床上可以根據(jù)其不同類型劃分為α-地中海貧血、 β-地中海貧血和異常血紅蛋白病等[8]。正常人有4個α基因，分別位于第16對染色體上，若其中3個α基因缺失，出生時血紅素會偏低。若是4個α基因都缺失，在胎兒時期就會因α2γ2不足，而引起重度貧血，導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎，或出生不久即死亡[9-10]。如果父母親都是2個α基因缺失的攜帶者，生下重度貧血患兒的機率為1/4。正常人有2個β基因，分別位于第11對染色體上，若是單基因突變，為輕度地中海貧血，而雙基因突變者，常表現(xiàn)為中或重度β型地中海貧血，出生時癥狀不明顯，到4～6個月大的時候，才會逐漸表現(xiàn)貧血的癥狀，并且終生都需要進行輸血治療或進行骨髓移植治療[11]。重癥地中海貧血患兒的出生給患兒家庭帶來極大的痛苦和經(jīng)濟負擔(dān)，嚴重影響當?shù)氐娜丝谫|(zhì)量，因此預(yù)防地中海貧血、減少出生缺陷是提高人口質(zhì)量的戰(zhàn)略需求。

本次研究中直接采用外周靜脈血進行地中海貧血基因診斷，未經(jīng)過常規(guī)地中海貧血篩查(血常規(guī)檢測、血紅蛋白電泳)，極大地減少了地中海貧血基因攜帶者的漏檢，能夠檢出更多的地中海貧血基因攜帶者，更實際地反映本地人群中地中海貧血基因攜帶的情況。本研究共對6 586例育齡婦女進行地中海貧血基因檢測，檢出地中海貧血基因攜帶者680例，攜帶率為10.32%。在本次篩查中α-地中海貧血基因攜帶者336例，α -地中海貧血基因攜帶率為5.10%。篩查共檢出11種α-地中海貧血基因型，其中α -地中海貧血缺失型主要為東南亞型缺失(--SEA/α α)雜合子和右側(cè)缺失型(-α3.7/α α)雜合子，占α -地中海貧血的39.88%和39.58%，是本地α -地中海貧血的主要類型，與國內(nèi)其他省份的研究較一致；α -地中海貧血突變類型主要為CSM雜合子，占α -地中海貧血的7.44%與涂志華等[12]所作海南省陵水黎族育齡婦女檢測結(jié)果不同。本研究共檢出 β -地中海貧血基因攜帶者323例，攜帶率為4.90%，有14種基因型，其中檢出17M雜合子122例、41-42M雜合子135例，占β地中海貧血的37.77%和41.79%%，是本地 β -地中海貧血基因突變主要類型；混合型地中海貧血攜帶者21例，有7種基因型，攜帶率為0.32%。本次研究結(jié)果與劉興梅等[13]、黃盛芳等[14]所做貴州省人群的地中海貧血基因檢測結(jié)果較一致，α -地中海貧血的主要類型都為東南亞地貧缺失型； β -地中海貧血的主要類型為41-42M和17M；但低于廣西、海南等地[15-16]，而所作重慶、云南地區(qū)人群較一致[17-18]。這一差異可能與地域有關(guān)，廣西、福建、海南等地靠近赤道為瘧疾高發(fā)地區(qū)，紅細胞的變異能夠逃避瘧原蟲的攻擊，使其免于瘧疾感染[19]，因此疾病在這一地區(qū)表現(xiàn)高發(fā)。本研究的6 586例受檢者主要由4個民族構(gòu)成，其中漢族2870例、有314例攜帶有地中海貧血基因(攜帶率為10.94%)，土家族1529例，有152例攜帶有地中海貧血基因(攜帶率9.94%)，1352例苗族共檢出地中海貧血基因攜帶者141例(攜帶率10.42%)，835例侗族檢出地中海貧血基因攜帶者73例(攜帶率8.74%)。各民族間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這可能與本地各族群之間相互融合，通婚，使基因分布頻率發(fā)生了改變所致。此次研究結(jié)果顯示各民族之間的地中海貧血基因攜帶率高于楊先燕等[20]所作的研究。通過本次研究，了解銅仁市各民族地中海貧血基因的攜帶情況，能夠根據(jù)各民族地中海貧血基因的遺傳特點制定相應(yīng)的防控措施。

綜上所述，本研究提示在本地育齡婦女中地中海貧血基因攜帶率較高，以α -地中海貧血和β -地中海貧血為主，純合仔和復(fù)合型地中海貧血較少。