王炳清， 馬慶波， 劉敬博， 高俊波

(北大醫(yī)療魯中醫(yī)院 神經(jīng)外科， 山東 淄博 255400)

膠質(zhì)瘤是一種常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，發(fā)病后患者表現(xiàn)出惡心嘔吐、頭痛、視覺模糊、癲癇等癥狀，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)視覺喪失、肢體疼痛或麻木、肌力弱、運(yùn)動(dòng)與感覺障礙，臨床多給予患者手術(shù)聯(lián)合放化療，該病很難根治，術(shù)后復(fù)發(fā)率也較高[1-2]，預(yù)后不佳，因此探討其發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制和基因表達(dá)調(diào)節(jié)規(guī)律對(duì)于改善患者預(yù)后有著重要的意義[3-4]。Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路(Wnt/β-catenin)是生物進(jìn)化中調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和凋亡的重要通路，其異常激活與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展均密切相關(guān)[5]，推測(cè)干預(yù)該通路可幫助治療膠質(zhì)瘤[6]。頭痛、頭風(fēng)、真頭痛、厥逆等癥狀，中醫(yī)認(rèn)為屬于外感六邪或內(nèi)傷七情而致機(jī)體氣血陰陽失衡，郁結(jié)于腦內(nèi)所致[7-8]；而中藥材靈芝性溫、味甘，具有補(bǔ)中益氣、扶正固本、滋補(bǔ)強(qiáng)壯的功效[9]，因此本文選取靈芝的主要成分之一靈芝三萜作用于人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251細(xì)胞，觀察對(duì)細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡的影響，分析靈芝三萜通過Wnt信號(hào)通路對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫內(nèi)購入人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251。

1.1.2主要儀器及試劑 (dulbecco's modification of eagle's medium dulbecco，DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜及Transwell小室購自美國Thermo Fisher公司，靈芝三萜(99%純度)購自杭州甫洛生物科技有限公司，Wnt/β-catenin通路的檢測(cè)試劑盒及相關(guān)試劑購自美國Sigma公司，兔抗人β-catenin多克隆體、兔抗人p-GSK-3β多克隆體購自英國Abcam公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司，HBS-1096B酶標(biāo)儀購自南京德鐵試驗(yàn)設(shè)備公司。

1.2 方法

1.2.1分組及細(xì)胞培養(yǎng) 本研究將U251細(xì)胞分為4組：空白對(duì)照組未進(jìn)行藥物處理，低、中、高劑量組分別給予10、50 及100 mg/L的靈芝三萜處理。將人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞復(fù)蘇后接種于DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，內(nèi)含10%FBS，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液1次，細(xì)胞密度達(dá)85%時(shí)使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期期U251細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)，密度為1×109個(gè)/L，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜，細(xì)胞貼壁后，采用10、50 及100 mg/L的靈芝三萜及等量的PBS分別處理U251細(xì)胞，置37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于藥物處理后培養(yǎng)24、48及72 h時(shí)，加入10 μL CCK8試劑，37 ℃培養(yǎng)4 h。使用酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)490 nm處的吸光度(OD值)，取平均值，該OD值代表細(xì)胞的增殖能力。

1.2.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 藥物處理后各組U251細(xì)胞均使用胰酶消化，使用改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液懸浮并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108個(gè)/L，Transwell小室上室加100 μL細(xì)胞懸液，將下室內(nèi)加入DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS)500 μL，設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24 h。取出小室，PBS洗滌2次，多聚甲醛(4%)固定30 min，1%結(jié)晶染色10 min，PBS洗滌并晾干，隨機(jī)選取3個(gè)視野在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞侵襲數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 藥物處理后的貼壁細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞在6孔板內(nèi)接種，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞貼壁單層生長(zhǎng)時(shí)，使用無菌移液槍對(duì)6孔板表面垂直直線劃痕，PBS洗去脫落細(xì)胞，更換培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，使用顯微鏡觀察劃痕距離并計(jì)算細(xì)胞遷移率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將藥物處理后5×105個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞接種在75 mL的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入10 mL F12培養(yǎng)液，干預(yù)24 h后，收集懸液及貼壁細(xì)胞，加入Annexin V-FITC488和PI溶液，室溫下避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)3次，取平均值。

1.2.6Western blot檢測(cè)β-catenin、p-GSK-3β蛋白表達(dá) 取1.2.1中的細(xì)胞提取蛋白，加適量放射免疫沉淀(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液冰上裂解細(xì)胞(30 min)，置于4 ℃環(huán)境中以12 000 r/min離心30 min，吸取上清液。取等量總蛋白上樣，12.5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(dodecyl sulfate,sodium salt -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳，直至電泳道膠的底端，轉(zhuǎn)膜，無蛋白快速封閉液封閉20 min，加一抗(1 ∶10 000)、二抗(1 ∶10 000)，以β-actin為內(nèi)參，使用Image J軟件分析蛋白表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，藥物作用各時(shí)點(diǎn)，對(duì)照組的OD值高于各靈芝三萜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著靈芝三萜濃度的升高藥物作用各時(shí)點(diǎn)的OD值均逐漸降低，但隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)不同濃度靈芝三萜各組的OD值均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 靈芝三萜對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響

2.2 對(duì)細(xì)胞侵襲的影響

結(jié)果顯示，藥物作用各時(shí)點(diǎn)，對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)均多于各靈芝三萜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；靈芝三萜作用24、48及72 h時(shí),隨著靈芝三萜濃度的升高侵襲細(xì)胞數(shù)均逐漸減少，但隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)、不同濃度靈芝三萜轉(zhuǎn)染下的侵襲細(xì)胞數(shù)均增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 靈芝三萜對(duì)U251細(xì)胞侵襲的影響

2.3 對(duì)細(xì)胞遷移的影響

結(jié)果顯示，藥物作用各時(shí)點(diǎn)，對(duì)照組的細(xì)胞遷移率均高于各靈芝三萜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著靈芝三萜濃度的升高各作用時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞遷移率均逐漸降低，但隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)不同濃度靈芝三萜轉(zhuǎn)染下的遷移率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 靈芝三萜對(duì)U251細(xì)胞遷移率的影響

2.4 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞各時(shí)點(diǎn)的凋亡率均高于各靈芝三萜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著靈芝三萜濃度的升高各作用時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞凋亡率均逐漸降低，但隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)不同濃度靈芝三萜轉(zhuǎn)染下的凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 靈芝三萜對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響

2.5 β-catenin蛋白表達(dá)的變化

結(jié)果顯示，對(duì)照組藥物各作用時(shí)間的β-catenin蛋白表達(dá)均高于各靈芝三萜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著靈芝三萜濃度的升高各作用時(shí)點(diǎn)的β-catenin蛋白表達(dá)均逐漸升高，但隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)不同濃度靈芝三萜轉(zhuǎn)染下的β-catenin蛋白表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表5。

表5 靈芝三萜對(duì)U251中β-catenin蛋白表達(dá)的影響

圖1 各組人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中β-catenin蛋白表達(dá)(Western blot)

2.6 p-GSK-3β蛋白表達(dá)的變化

結(jié)果顯示，對(duì)照組藥物作用各時(shí)間點(diǎn)的p-GSK-3β蛋白表達(dá)均高于各靈芝三萜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著靈芝三萜濃度的升高各作用時(shí)點(diǎn)的p-GSK-3β蛋白表達(dá)均逐漸升高，但隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)不同濃度靈芝三萜轉(zhuǎn)染下的p-GSK-3β蛋白表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表6。

表6 靈芝三萜對(duì)U251中p-GSK-3β蛋白表達(dá)的影響

圖2 各組人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中p-GSK-3β蛋白表達(dá)(Western blot)

3 討論

臨床中已有較多研究證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中均有重要作用，β-catenin在細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均存在，是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)樞紐[10]。正常狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)的Wnt信號(hào)通路未激活，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin與GSK-3β相結(jié)合，隨之被相應(yīng)受體磷酸化，并經(jīng)泛素酶降解，因此正常狀態(tài)下胞質(zhì)β-catenin水平始終較低。而當(dāng)Wnt信號(hào)通路被異常激活時(shí)，β-catenin蛋白則因無法被降解而大量聚集在胞質(zhì)內(nèi)，并遷移至細(xì)胞核中，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，促使該通路下游靶基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)[11-13]。因此當(dāng)Wnt信號(hào)通路受到外界刺激異常激活時(shí)，β-catenin發(fā)生突變會(huì)造成細(xì)胞周期異常變化，細(xì)胞增殖失控，凋亡過程抑制，誘發(fā)腫瘤[14]。而腫瘤發(fā)生的實(shí)質(zhì)則是癌細(xì)胞的持續(xù)分裂和增殖，因此通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，對(duì)于改善癌癥患者預(yù)后有重要意義[15]。

近年來中西醫(yī)結(jié)合治療膠質(zhì)瘤取得了一定的進(jìn)展，其中靈芝作為珍貴的中藥材也廣泛用于對(duì)癌癥患者的臨床治療中，作為抗腫瘤輔助藥物，靈芝不僅能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，對(duì)人體的毒副作用也較小[16-17]。但隨著各項(xiàng)研究的不斷深入，雖有研究已經(jīng)明確靈芝對(duì)癌癥患者具有一定的治療作用，但尚未明確靈芝在癌癥治療中的具體作用機(jī)制，尚未清楚其是通過哪一個(gè)方面發(fā)揮的作用[18]?？紤]到Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等過程的影響[19]，本研究選取靈芝的主要成分之一靈芝三萜作用于人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251細(xì)胞，觀察不同劑量和不同作用時(shí)間U251細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡的變化，分析靈芝三萜通過Wnt信號(hào)通路對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響，以期能為今后臨床治療提供指導(dǎo)。

靈芝三萜具有降血脂、降血糖、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等作用，是靈芝提取物的主要活性成分，已知其在細(xì)胞的增殖、鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和氧化應(yīng)激等生物過程中均有重要作用[20-21]。本文結(jié)果顯示，使用靈芝三萜培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株增殖、侵襲和遷移能力減弱，凋亡率升高，隨著靈芝三萜濃度的升高，這種作用愈發(fā)明顯，且該作用與Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)。既往研究中發(fā)現(xiàn)含羥基的靈芝三萜物質(zhì)靈芝酸A、H、F能夠?qū)θ橄侔┘?xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲產(chǎn)生抑制，這與本研究的結(jié)果相似。分析靈芝三萜的具體作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)靈芝三萜能夠?qū)C(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生作用，進(jìn)而影響中性粒細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)而阻止了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡過程產(chǎn)生了影響[22]。同時(shí)靈芝三萜提高了機(jī)體的免疫活性，促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞活化，增強(qiáng)了化療藥物的作用效果，增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，達(dá)到了較佳的臨床效果[23]。

β-catenin蛋白是與細(xì)胞骨架相互作用的多功能蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞分裂基因的啟動(dòng)；GSK-3β可調(diào)控糖原合成酶活性，介導(dǎo)信號(hào)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、存活和凋亡[24]。β-catenin、p-GSK-3β蛋白均為Wnt信號(hào)通路中的重要因子，本文中在靈芝三萜的作用下β-catenin、p-GSK-3β蛋白表達(dá)明顯降低，說明靈芝三萜對(duì)Wnt信號(hào)通路產(chǎn)生了影響，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡過程產(chǎn)生了影響。

綜上所述，靈芝三萜能夠通過Wnt信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。