肖婷， 郭正紅， 駱光佳， 張道芳， 陶玲， 沈祥春**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州省天然藥物資源高效利用工程中心， 天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550025; 3.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)又稱為酒精性肝損傷，是由酗酒引起的肝臟疾病，其中超過(guò)40%ALD患者死于酒精性肝硬化[1]。雖然ALD發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢(shì)，但發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，其針對(duì)性治療用藥也并不明確。研究顯示氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]，清除自由基和抗氧化是防治和治療ALD的主要途徑。乙醇在肝臟中主要通過(guò)乙醇脫氫酶，乙醛脫氫酶以及細(xì)胞色素P450進(jìn)行代謝，在此過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生過(guò)多活性氧(reactive oxygen species，ROS)，引起體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)紊亂，造成脂肝細(xì)胞損傷和死亡[3]。因此，含有抗氧化活性成分的植物資源成為開(kāi)發(fā)臨床治療ALD潛在藥物的關(guān)注重點(diǎn)。莓果類植物資源抗氧化活性最高，包括藍(lán)莓、枸杞及桑葚等。枸杞總黃酮能明顯降低丙二醛含量(malondialdehyde，MDA)，有效改善肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)肝臟具有較好的保護(hù)作用[4-5]。桑葚?zé)o糖提取物具有很強(qiáng)的抗氧化能力，我國(guó)歷代的中醫(yī)本草公認(rèn)桑葚有補(bǔ)肝益腎、降壓消渴和解酒的功效，可用于治療肝腎陽(yáng)虛[6-7]。當(dāng)前，藍(lán)莓、枸杞及桑葚這3種植物資源受到廣泛關(guān)注，但是將其ALD保護(hù)作用進(jìn)行對(duì)比研究卻很少。本研究通過(guò)建立慢性小鼠ALD模型，觀察藍(lán)莓、枸杞及桑葚提取物對(duì)ALD小鼠肝臟的保護(hù)作用，并進(jìn)行相互間效果差異對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性昆明種小鼠110只，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào) SCXK(遼)2015-0001]。

1.1.2莓果與主要試劑 藍(lán)莓(黑龍江九三局山河農(nóng)場(chǎng)藍(lán)莓公司)，桑葚(貴州安龍大秦農(nóng)業(yè)公園)，枸杞(寧夏杞天下生物科技有限公司)；無(wú)水乙醇(上海沃凱生物試劑有限公司)，甲醛(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.3主要儀器 BS110S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，F(xiàn)D-1D-50冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，KH-300B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲波儀器有限公司)，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，TBA-40FR自動(dòng)生化分析儀(日本東芝醫(yī)療系統(tǒng)株式會(huì)社)，XDS-2B倒置顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2 研究方法

1.2.1造模及分組 參照文獻(xiàn)[8]的造模及實(shí)驗(yàn)方法。110只小鼠隨機(jī)均分為空白組、模型組、藍(lán)莓提取物[25(低)、50(中)及100 mg/kg(高劑量)]組、枸杞提取物[25(低)、50(中)及100 mg/kg(高劑量)]組、桑葚提取物[25(低)、50(中)及100 mg/kg(高劑量)]組。適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，用于慢性酒精性肝損傷實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)周期為 1 個(gè)月，此期間，空白組小鼠不做任何干預(yù)，自由給予水，與其他組喂養(yǎng)相同的飼料；模型組小鼠前15 d不做干預(yù)，后15 d每日定時(shí)灌胃30%乙醇(10 mL/kg) 進(jìn)行造模；藍(lán)莓、枸杞、桑葚提取物(低、中、高劑量)組小鼠每日定時(shí)灌胃相應(yīng)劑量的莓果提取物 (5‰ CMC-Na 混懸)，實(shí)驗(yàn)前15 d每日定時(shí)灌胃不同劑量的莓果提取物，4 h 后灌胃給予30%乙醇進(jìn)行慢性肝損傷模型制備。

1.2.2體質(zhì)量和肝臟指數(shù)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組小鼠禁食 4 h，稱量體質(zhì)量，經(jīng)腹腔注射60 mg/kg 戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉，摘眼球取血；取各組小鼠肝臟組織，生理鹽水洗凈，吸干多余水分后進(jìn)行稱重并計(jì)算肝臟指數(shù)。

1.2.3血清生化指標(biāo)檢測(cè) 取“1.2.2”項(xiàng)下各組小鼠血清適量，靜置1 h，1 500 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃低溫保存，于自動(dòng)生化分析儀中檢測(cè)各組小鼠血清膽固醇(cholesterol，CHOL)、血清總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST) 含量。

1.2.4蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE ) 取“1.2.2”項(xiàng)下各組小鼠肝左葉組織于10%甲醛中保存48 h，用于肝臟組織病理學(xué)檢查；38%鹽酸1 mL和75%乙醇99 mL配置成1%鹽酸乙醇分化液，28% 氨水0.2 mL和蒸餾水100 mL 配置成0.2%氨水，pH調(diào)至7.5；60 ℃ 下烤片2 h，二甲苯中脫蠟5～10 min，移入二甲苯和純酒精(1 ∶1)混合液中5 min，依次加入100%、95%、85%、70%酒精浸泡，2～5 min/次；蒸餾水清洗，蘇木精染液染色5～15 min，1%鹽酸乙醇分化液分色；鏡檢控制，直至細(xì)胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止；0.2%氨水中堿化或藍(lán)化，即細(xì)胞核呈藍(lán)色；蒸餾水短洗 1 min，0.3%伊紅染液染色5 min；蒸餾水短洗1 min，37 ℃烘干0.5 h，中性樹(shù)膠封固；觀察各組小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)改變情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)前，各組小鼠狀態(tài)均良好，體型適中，毛色有光澤，活動(dòng)靈敏，胃口較好，睡眠良好，情緒較為穩(wěn)定，無(wú)相互撕咬現(xiàn)象；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，空白組小鼠一般狀態(tài)與實(shí)驗(yàn)前差異不大，而模型組小鼠狀態(tài)差、毛色暗黃無(wú)光且蓬松、出現(xiàn)嚴(yán)重掉毛和相互撕咬現(xiàn)象、胃口較差、體型消瘦，桑葚提取物組小鼠狀態(tài)一般、皮毛顏色偏黃略有蓬松、體型稍顯瘦弱、動(dòng)作靈敏、情緒尚且穩(wěn)定，藍(lán)莓提取物組和枸杞提取物組小鼠狀態(tài)略差、皮毛松軟、顏色微黃同時(shí)出現(xiàn)少量皮毛脫落現(xiàn)象、情緒較暴躁、出現(xiàn)相互撕咬現(xiàn)象、反應(yīng)略遲鈍。

2.2 體質(zhì)量和肝臟指數(shù)

與空白組相比，模型組小鼠體質(zhì)量明顯減輕、肝臟指數(shù)明顯升高 (P<0.001)；與模型組相比，桑葚提取物低、中、高劑量組小鼠體質(zhì)量升高、肝臟指數(shù)下降 (P<0.05)，而枸杞和藍(lán)莓提取物低、中、高劑量組間小鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)比較、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)

2.3 血清ALT、AST、LDL、TBIL及CHOL水平

與空白組相比，模型組小鼠血清ALT、AST、LDL、TBIL及CHOL 含量明顯升高 (P<0.001)；與模型組相比，枸杞和桑葚提取物低、中及高劑量組小鼠血清ALT、AST、LDL、TBIL及CHOL含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01或P<0.001)；與模型組相比，藍(lán)莓提取物低、中及高劑量組小鼠血清AST、LDL、TBIL及CHOL含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，3組提取物低、中及高劑量小鼠血清ALT、AST、LDL、TBIL及CHOL水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清ALT、AST、LDL、TBIL及CHOL水平

2.4 HE染色

空白組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)大小規(guī)整，輪廓清晰，細(xì)胞間緊密接觸，以中央靜脈為中心大致呈放射狀排列；模型組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)廣泛的空泡變性、氣球樣變，肝細(xì)胞水腫，胞漿成顆粒狀；桑葚提取物低劑量組小鼠肝細(xì)胞廣泛的水腫、并伴有炎癥，中劑量組小鼠胞質(zhì)形成空泡化、匯管區(qū)域周圍的肝細(xì)胞胞質(zhì)變性、并且細(xì)胞間嗜酸性顆粒密度增加，高劑量組較模型組的空泡變性顯著減少、且肝細(xì)胞大小形態(tài)無(wú)明顯異常、著色清晰、組織細(xì)胞排列均勻、較其他提取物劑量組更接近空白組肝細(xì)胞形態(tài)；枸杞提取物低劑量組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)廣泛的水腫及空泡變性、伴有細(xì)胞核破裂，中劑量組小鼠肝細(xì)胞部分組織邊緣有壞死、且觀察到部分肝細(xì)胞有明顯的嗜酸性變，高劑量組小鼠肝細(xì)胞有輕度水腫、可見(jiàn)少許空泡變性、中央靜脈周圍肝細(xì)胞水樣變性；藍(lán)莓提取物低劑量組小鼠肝細(xì)胞存在廣泛的水腫、空泡變性及氣球樣變，中劑量組小鼠肝細(xì)胞依然存在大量的空泡變性及嗜酸性變，高劑量組組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)少量空泡變性和水樣變性、肝細(xì)胞水腫；由此可見(jiàn)3種莓果提取物均可改善小鼠肝臟病變程度，但作用強(qiáng)弱有別，桑葚提取物表現(xiàn)出了最好的改善作用，其次為枸杞和藍(lán)莓。見(jiàn)圖1。

注：A為空白組，B為模型組，C～E分別為桑葚提取物低、中、高劑量組，F(xiàn)～H分別為枸杞提取物低、中、高劑量組，I～K分別為藍(lán)莓提取物低、中、高劑量組。

3 討論

ALD是由于長(zhǎng)期大量飲酒，從而使得酒精與肝臟細(xì)胞頻繁接觸而導(dǎo)致肝臟損傷[2]。ALD可使肝臟細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，造成肝臟細(xì)胞壞死、凋亡、炎癥、纖維化等病理變化，最終導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌等疾病[9]。在我國(guó)，ALD占同期住院肝病患者構(gòu)成比呈逐年上升趨勢(shì)[10]。研究證明，長(zhǎng)期過(guò)量飲酒導(dǎo)致小鼠食欲和吸收功能降低[11]，易造成小鼠營(yíng)養(yǎng)不良、體質(zhì)量下降[12]；肝損害會(huì)引起小鼠肝腫大、發(fā)育不良和肝硬化，肝臟指數(shù)在一定程度上可以反映肝臟的損傷[13]，當(dāng)肝臟指數(shù)增加時(shí)，很可能是肝臟發(fā)生了腫大，發(fā)生增生、充血及水腫等病變[14]。本研究中模型組小鼠體質(zhì)量較空白組下降、肝臟指數(shù)升高，說(shuō)明造模成功；而采用莓果提取物進(jìn)行預(yù)保護(hù)的給藥組，體質(zhì)量和肝指數(shù)均較模型組有所改善，在一定程度上對(duì)慢性ALD具有保護(hù)作用。

細(xì)胞酶是人體代謝過(guò)程中必不可少的催化劑[15]。ALD中存在脂代謝紊亂和轉(zhuǎn)氨酶活性改變，由于酒精濫用會(huì)損害細(xì)胞膜的滲透性，導(dǎo)致儲(chǔ)存在肝臟中的細(xì)胞酶會(huì)滲漏到血漿中[16]。血清ALT、AST、TBIL、CHOL及LDL是ALD的敏感觀察指標(biāo)，其中血清ALT和AST是肝臟功能重要的診斷指標(biāo)[15，17-18]。ALT主要分布在肝細(xì)胞漿，AST主要分布在肝細(xì)胞漿和肝細(xì)胞的線粒體中，在正常情況下，2種酶只有極少量釋放入血液中，故血清中2種酶的活性很低，但當(dāng)肝組織受到急性損傷或細(xì)胞膜通透性增加時(shí)，ALT和AST大量釋放到血液中，血清中酶的活性明顯增高，因此血清ALT和AST升高幅度能反映肝細(xì)胞受損程度[19-21]。血清CHOL和LDL是診斷肝臟脂質(zhì)代謝的重要指標(biāo)，且游離CHOL是炎癥的潛在誘因和肝纖維化的驅(qū)動(dòng)因素[18]。脂質(zhì)代謝異常作為ALD的一種并發(fā)癥狀，表現(xiàn)為酒精及代謝產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致血液中LDL含量增加，同時(shí)引起CHOL含量升高[18，21]。作為肝臟功能的重要診斷工具，血清TBIL水平與代謝綜合征有密切的關(guān)系，如動(dòng)脈粥樣硬化和肝臟疾病[22]。TBIL主要由衰老的紅細(xì)胞在肝、脾和骨髓等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)內(nèi)破壞降解而來(lái)，當(dāng)肝細(xì)胞功能受到損傷或結(jié)構(gòu)被破壞，或者膽汁排泄通路的障礙，其攝取、轉(zhuǎn)化和排泄膽紅素的能力降低，可導(dǎo)致膽汁攝取、轉(zhuǎn)化、分泌及運(yùn)輸障礙，使肝臟清除膽紅素的能力下降，使TBIL值增高[23]。因此以血清ALT、AST、LDL、CHOL及TBIL為指標(biāo)，對(duì)小鼠肝損傷程度進(jìn)行檢測(cè)具有參考意義。本研究結(jié)果顯示，3種莓果提取物均能夠不同程度地降低小鼠各血清指標(biāo)，保護(hù)慢性酒精性肝損傷。

酒精在肝臟中通過(guò)乙醇脫氫酶和微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行氧化代謝，主要中間代謝產(chǎn)物為乙醛，乙醛進(jìn)一步在乙醛脫氫酶的作用下生成乙酸[24]。ALD主要是乙醇及其衍生物乙醛的代謝過(guò)程中直接或間接誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、腸源性內(nèi)毒素、炎性介質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)失衡等多種因素相互作用的結(jié)果，導(dǎo)致肉眼可見(jiàn)肝臟體積明顯腫大、色黃、膩感及質(zhì)地脆[24-25]；光鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞體積腫脹、氣球樣變及點(diǎn)狀壞死，變性的肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)嗜酸性包涵體、周圍常見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[26-27]。本研究結(jié)果表明，模型組小鼠肝組織出現(xiàn)了空泡變性、水腫及肝細(xì)胞排列混亂等損傷，而3種莓果提取物對(duì)肝組織的水腫、變性等損傷有一定的改善作用，尤其是桑葚提取物高劑量組，其改善后肝組織和空白組相差不大。莓果提取物可通過(guò)抗氧化、促進(jìn)凋亡等方式保護(hù)小鼠慢性ALD[8]。3種莓果提取物均可改善乙醇造成的小鼠肝臟損傷，但改善作用強(qiáng)弱有所差異，可能與它們含有的酚酸、黃酮以及花色苷等成分差異有關(guān)，具體的干預(yù)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，通過(guò)對(duì)小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)和血清ALT、AST、TBIL、CHOL、LDL水平及肝臟病理組織切片觀察進(jìn)行分析可知，藍(lán)莓、枸杞及桑葚3種莓果提取物均對(duì)小鼠慢性ALD有一定的改善作用，但改善作用強(qiáng)弱有一定差異，桑葚提取物表現(xiàn)出了最強(qiáng)的活性，其次為枸杞和藍(lán)莓提取物。本研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步闡述莓果類提取物對(duì)ALD的輔助保護(hù)作用，為莓果類食源性天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)成為輔助保護(hù)肝損傷功能食品提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。