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        多黏菌素B對大鼠全腦缺血再灌注時脂多糖所致?lián)p傷的保護作用及機制*

        2021-10-14 10:12:08鄭思敏李思遠牛曉麗楊毅猛薛榮亮
        貴州醫(yī)科大學學報 2021年9期
        關(guān)鍵詞:海馬

        鄭思敏, 李思遠, 牛曉麗, 楊毅猛, 薛榮亮

        (西安交通大學第二附屬醫(yī)院 麻醉科, 陜西 西安 710041)

        研究表明,腦缺血再灌注損傷的機制由多因素共同參與并相互作用。低血壓、休克、心臟驟??芍氯矶嗥鞴偃毖?,其中腸道是敏感器官。腸道缺血引起腸黏膜屏障受損,大量釋放細菌內(nèi)毒素入血,啟動多損傷環(huán)節(jié),對腸外器官造成損傷[1]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)存在于革蘭陰性菌的細胞膜上,是一種內(nèi)毒素,在對動物發(fā)病機理的研究中,LPS作為主要的炎癥因子,可引起機體發(fā)熱、血壓下降、激活炎癥反應(yīng)等[2]。研究發(fā)現(xiàn),LPS多聚體與宿主的LPS結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)結(jié)合后,激活外周血單核細胞表面的LPS受體,即白細胞分化抗原14(cluster of differentiation 14,CD14),通過LPS/ Toll樣受體4 (toll like receptor 4,TLR4)信號通路激活相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等早期促炎因子的生成,如血小板激活因子、白三烯等促炎因子,進而加重各器官的損傷[3]。多黏菌素是從多黏桿菌中分離的一類抗生素,用于臨床的有多黏菌素B(polymycin B,PMB)和多黏菌素E(polymycin E,PME),PMB通過其具有疏水性的陽離子結(jié)構(gòu)與類脂A特異性結(jié)合,抑制LPS的生物活性[4]。關(guān)于PMB在腦缺血再灌注損傷的中的作用機制目前尚未完全清楚,因此,本研究通過建立大鼠全腦缺血再灌注損傷模型,并尾靜脈注射用PMB及LPS,分析大鼠的神經(jīng)行為學評分、海馬組織的細胞凋亡率、LPS含量及TLR4表達情況。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1實驗動物及分組 健康清潔的成年雄性SD大鼠144只,體質(zhì)量200~250 g,由西安交通大學醫(yī)學院動物中實驗心提供,按照隨機數(shù)字表法分為對照組(SH組)、模型組(IR組)、脂多糖組(LPS組)和多黏菌素B組(PMB+LPS組),每組36只。后3組大鼠采用經(jīng)典四血管法建立大鼠全腦缺血再灌注模型[5],LPS組再灌注后即刻尾靜脈注射LPS(500 μg/kg)[6],PMB+LPS組再灌注后即刻尾靜脈注射LPS、注射完畢后立即更換注射器尾靜脈注射PMB(0.5 mg/kg)[7],SH組及IR組再灌注后即刻注射等量生理鹽水。每組根據(jù)再灌注時間的不同再分為2、6、12、24、48及72 h 六個亞組,每亞組6只。各組大鼠按要求在預(yù)定時間點麻醉后處死。

        1.1.2試劑和儀器 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析試劑盒購自美國R&D Systems公司,LPS購自美國sigma公司PMB購自美國INALCO公司,Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司;液氮罐由中國成都生產(chǎn),超凈工作臺購自美國Airtech公司,低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司,包埋機購自德國leica公司,烤片機購自德國leica公司,石蠟切片機購自德國leica公司,倒置顯微鏡購自德國leica公司,計算機圖像分析系統(tǒng)購自德國leica公司。

        1.2 實驗方法

        1.2.1模型制備 采用四血管法建立大鼠全腦缺血再灌注模型[5]。10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射對大鼠進行麻醉,大鼠翻正反射及痛覺消失視為麻醉滿意;麻醉滿意后采用俯臥位固定四肢,頭前傾約30°,同時用橡皮筋栓住大鼠尾巴以輕微力量牽拉,使頸椎伸直,此時翼小孔呈水平位便于觀察;取枕骨下第一頸椎水平做正中切口,逐層分離肌肉,仔細分離雙側(cè)第一頸椎橫突,暴露翼小孔,雙側(cè)翼小孔下各有椎動脈通過,用燒紅的探針刺入翼小孔燒灼椎動脈,使之永久閉塞,避免損傷脊髓及枕后三角區(qū)神經(jīng),逐層縫合皮下及皮膚。術(shù)后單籠飼養(yǎng),保持室溫20~25 ℃,并用60 W白熾燈持續(xù)照射24 h,防止體溫下降;同時保持大鼠呼吸道通暢,密切觀察其復(fù)蘇過程。術(shù)后第2天,同法麻醉后仰臥位固定,取頸正中切口,仔細分離雙側(cè)頸總動脈(注意勿傷及與之伴行的迷走神經(jīng))、分別微動脈夾夾閉6 min、松開微動脈夾恢復(fù)腦血流、逐層嚴密縫合。術(shù)后單籠飼養(yǎng),條件如前。SH組僅進行組織解剖及縫合,不給予凝斷椎動脈及夾閉雙側(cè)頸總動脈處理。

        1.2.2神經(jīng)行為學評分[9]大鼠處死前30 min由一名不清楚實驗分組的研究人員對所有大鼠進行神經(jīng)行為學評分,分為步態(tài)協(xié)調(diào)、平衡木實驗及斜扳試驗。(1)步態(tài)協(xié)調(diào):缺失(表現(xiàn)為靜止或原地轉(zhuǎn)圈)記1分,不正常(表現(xiàn)為步態(tài)搖晃且速度減慢)記2分,正常記3分。(2)平衡木實驗:大鼠放置于長1 m、寬2 cm、離地面0.5 m的圓形平衡木上,記錄大鼠的表現(xiàn);立即脫落記1分,試圖停留記2分,可正常停留記3分。(3)斜扳試驗:將大鼠頭向下倒置在45°斜面上,觀察大鼠是否能轉(zhuǎn)為頭向上>135°及爬行情況,迅速轉(zhuǎn)為頭向上>135°、且可順利向上爬記1分,抓握斜面>5 s后轉(zhuǎn)為頭向上>135°、爬行困難記2分,順斜面下滑記3分。

        1.2.3LPS含量 各組大鼠按要求在預(yù)定時間點麻醉后處死、斷頭,撬開顱骨,完整取出大腦組織置于盛有4 ℃ PBS溶液的培養(yǎng)皿中,剝離腦膜和腦皮質(zhì)分離出雙側(cè)海馬組織,立即置入液氮罐凍存,后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存,1個月內(nèi)進行ELISA檢測LPS含量。

        1.2.4細胞凋亡率檢測[8]按照1.2.3的方法分離出大鼠雙側(cè)海馬組織,再用PBS溶液洗去海馬組織上殘留血液后放入裝有4 ℃ PBS溶液的離心管中,置入冰盒保存,在30 min內(nèi)進行流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

        1.2.5海馬CA1區(qū)TLR4陽性表達 將不同時間點處死的各組大鼠沿枕骨撬開顱骨,仔細剝離蛛網(wǎng)膜及軟膜,取出完整大腦,在視交叉后1 mm及視交叉后4 mm處各切一刀(即海馬頭端)取冠狀面組織塊;于4%多聚甲醛液中浸泡,4 ℃保存3 d,常規(guī)石蠟包埋,并采用切片機連續(xù)腦冠狀面切片制備蠟塊。按照試劑盒說明書進行HE染色,在光鏡下觀察各組大鼠各時點缺血再灌注的右側(cè)海馬組織病理學變化,胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色即表示陽性細胞,隨機選擇海馬CA1區(qū)5個視野(× 400)進行陽性細胞計數(shù)。

        1.3 統(tǒng)計學處理

        2 結(jié)果

        2.1 神經(jīng)行為學評分

        結(jié)果顯示,隨著時間的延長,與LPS組相比,IR組和LPS+PMB組大鼠的神經(jīng)行為學評分增加(P<0.05),但上述3組各時點評分均低于SH組(P<0.05)。見表1。

        表1 再灌注后不同時點4組大鼠神經(jīng)行為學評分

        2.2 海馬組織LPS含量

        結(jié)果顯示,4組大鼠各時點LPS含量比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中SH組各時點海馬區(qū)LPS含量最低,LPS組最高(P<0.05)。隨著時間的延長,IR組和LPS組大鼠海馬組織LPS含量均于再灌注2 h時開始增多,24 h達高峰,隨后緩慢下降,且各時間點均明顯高于SH組(P<0.01);LPS+PMB組大鼠海馬組織各時間點LPS含量較LPS組均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

        表2 再灌注后不同時點4組大鼠海馬組織LPS含量

        2.3 海馬細胞凋亡率

        結(jié)果顯示,SH組海馬細胞各時點細胞凋亡率變化不明顯(P>0.05),其他3組于再灌注后2 h海馬細胞的凋亡率開始升高、24 h達峰值、72 h開始下降;各時點海馬細胞凋亡率比較LPS組>IR組>LPS+PMB組>SH組(P<0.05)。見表3。

        表3 再灌注后不同時點4組大鼠海馬細胞凋亡率

        2.4 海馬CA1區(qū)椎體細胞損傷

        HE染色結(jié)果顯示,與SH組比較,IR組各亞組大鼠海馬CA1區(qū)椎體細胞受損嚴重;LPS組2 h亞組大鼠海馬可見少量異常椎體細胞,胞漿強嗜酸性變、核固縮、無核仁消失,隨再灌注時間延長,椎體細胞排列紊亂、異常細胞數(shù)目增多、體積縮小,胞漿、胞核固縮明顯,可見核仁消失,核碎裂,溶解;以24 h亞組受損最為嚴重。LPS+PMB組大鼠海馬組織學改變介于LPS組與IR組之間。再灌注24 h各組海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)見圖1。

        注:箭頭所指為陽性細胞。

        2.5 海馬CA1區(qū)TLR4陽性細胞指數(shù)

        結(jié)果顯示,SH組及IR組大鼠海馬CA1區(qū)各時點TLR4表達較少,LPS組大鼠海馬CA1區(qū)大鼠海馬CA1區(qū)TLR4的表達于再灌注2 h時即出現(xiàn)升高、24 h達高峰、72 h表達下降(P<0.05);與LPS組相比,LPS+PMB組及IR組大鼠海馬CA1區(qū)各時點的TLR4表達均下降(P<0.05)。見表4、圖2。

        注:箭頭所指為陽性細胞。

        表4 再灌注后不同時點4組大鼠海馬CA1區(qū)TLR4陽性細胞指數(shù)

        3 討論

        當機體處于低血壓、休克、心臟驟停及腦卒中等狀態(tài)中時可出現(xiàn)腦缺血再灌注[10],因為腦組織的能量幾乎完全依靠葡萄糖的有氧氧化提供,其能量儲備十分有限,故對缺氧耐受性極差[11]。因此,缺血再灌注會引起一系列的病理生理改變,使大腦出現(xiàn)嚴重的機能障礙。有研究發(fā)現(xiàn),常溫狀態(tài)下,完全缺血10 s,腦組織儲備氧即可耗盡,葡萄糖有氧代謝終止,2~4 min腦組織儲存的葡萄糖及糖原耗竭,完全缺血4 min后,腦組織內(nèi)能量幾乎為零,最終導(dǎo)致大腦功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變[12]。因此,對于腦缺血再灌注的病理生理及保護機制的研究至關(guān)重要。

        細胞凋亡(apoptosis)是機體細胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的程序化死亡過程,具有主動性、選擇性、可逆性的特點。它的發(fā)生受到機體的嚴密調(diào)控。凋亡并不完全等同于程序性的細胞死亡(programmed cell death,PCD),凋亡是腦缺血再灌注損傷的主要病理生理機制之一[13]。腸道是失血性休克缺血再灌注損傷受累最早的器官之一,是應(yīng)激反應(yīng)的中心,且腸道對休克的反應(yīng)最敏感。在休克有效循環(huán)血量減少時,機體為維持心、腦等重要臟器的血液供應(yīng),全身血液重新分配,胃腸道血流明顯減少。低血容量尚未產(chǎn)生全身癥狀或生命體征變化時小腸和結(jié)腸的血流已減少50%,故腸道缺血發(fā)生在早期[14-16]。即使經(jīng)過復(fù)蘇,在血流動力學恢復(fù)正常后,腸道血流量仍低于正常水平。腸內(nèi)細菌經(jīng)腸黏膜至局部淋巴結(jié)或血液的這一現(xiàn)象稱為細菌移位,細菌移位可引發(fā)菌血癥或膿毒血癥,感染組織器官。腸道細菌和內(nèi)毒素吸收入血,作用于靶器官,釋放大量炎性介質(zhì)、氧自由基,前列腺素及多種細胞因子,損傷內(nèi)皮細胞,產(chǎn)生細胞毒效應(yīng)和全身代謝紊亂,最終導(dǎo)致遠端器官的損害[17-19]。已經(jīng)有研究報道LPS對肺臟、肝臟、腎臟等組織缺血再灌注時的損傷作用[20],但對腦組織的研究未見報道。

        本研究結(jié)果表明,除對照組外,其他各組再灌注后2 h海馬神經(jīng)元開始發(fā)生凋亡,且凋亡率隨時間延長不斷升高,于24 h達峰值,72 h開始下降。且LPS組各時點的凋亡率均高于其他3組,提示LPS可增加全腦缺血再灌注導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元凋亡。但對LPS組小鼠尾靜脈注射PMB后,各時間點大鼠海馬區(qū)LPS含量均較LPS組減少,神經(jīng)元凋亡率下降,提示PMB可能對損傷起到一定的抑制作用[21-22]。

        進一步對各組大鼠進行神經(jīng)行為學評分,結(jié)果提示PMB+LPS組的評分高于LPS組,再次提示在大鼠全腦缺血再灌注時,PMB對內(nèi)毒素所致的神經(jīng)元損傷有保護作用。SH組各時點血清TLR4表達很少,而其他3組于再灌注2 h即出現(xiàn)升高,24 h達高峰,之后開始減少,但仍處于較高水平,且均高于SH組。研究還發(fā)現(xiàn)LPS組各時點均較IR組表達增加,而LPS+PMB組各時點均較IR組表達減少,提示PMB對大鼠全腦缺血再灌注時造成的損傷可以起到一定的保護作用,且這種保護作用可能是通過抑制了TLR4的表達而實現(xiàn)的[23-25]。

        綜上所述,全腦缺血再灌注時腦組織內(nèi)LPS含量隨時間不斷變化并造成大腦損傷,PMB對該種損傷有保護作用,可能是通過抑制TLR4的表達進而阻止損傷。

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