宋春灼， 李想， 李俊俊， 劉猛， 付立躍， 朱海濤1，***

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 肝膽外科， 貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院， 貴州 貴陽 550004)

膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是膽管上皮來源的惡性腫瘤，在原發(fā)性肝臟惡性腫瘤中排第二位[1]。根治性手術切除是目前CCA患者可能獲得長期生存的最佳治療手段[2]。但由于CCA患者早期無特異性臨床癥狀，大多數患者在明確診斷時已喪失手術機會[3]，因此，明確CCA在發(fā)生發(fā)展過程中的分子機制將對該病的早期診斷及臨床治療大有裨益。磷脂磷酸組氨酸無機焦磷酸磷酸酶(phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase，LHPP)是在牛肝組織中發(fā)現的一種磷酸酶[4]，有研究表明LHPP在肝癌、膀胱癌、宮頸癌和胰腺癌等多種實體惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[5-8]，而LHPP在CCA中的作用卻少見報道。因此，本研究通過在CCA細胞中過表達LHPP基因，觀察其對CCA細胞增殖能力的影響并探究其可能機制，為CCA的臨床治療策略提供理論基礎。

實踐中，許多自由貿易協定內包含有規(guī)定自貿園區(qū)貨物在自由貿易協定下如何對待的特殊條款。通常，自由貿易協定限制或禁止來源于成員國自貿園區(qū)安排下的貨物享有自由貿易協定的內部優(yōu)惠關稅，換言之，自由貿易協定中的自貿園區(qū)特殊條款將自貿園區(qū)貨物視為區(qū)域外產品，并應服從區(qū)域統一外部關稅安排。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株 人正常肝內膽管上皮細胞株HIBEpiC購于中國科學院細胞庫，CCA細胞株TFK-1、HuCCT-1由華中科技大學附屬同濟醫(yī)院膽胰實驗室惠贈。

1.1.2主要試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基、含0.25%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的胰酶溶液(美國Gibco)，胎牛血清(以色列BI)，1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液(美國Corning)，Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(上海Dojido)，聚凝胺(polybrene)、5×蛋白上樣緩沖液(5×loading buffer)及嘌呤霉素(北京Solarbio)，RIPA裂解液、4%多聚甲醛及0.01%結晶紫(廣州Affinity)，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ,GAPDH)、鼠抗人蛋白激酶B(protein kinase B ,AKT)、兔抗人抑癌基因(human tumor suppressor gene，P53)及兔抗人LHPP單克隆抗體(武漢Proteintech Group)，兔抗人磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B ,p-AKT)單克隆抗體(美國CST)，羊抗兔/鼠二抗(武漢Boster)，慢病毒包裝由上海吉滿生物公司完成；371型恒溫細胞培養(yǎng)箱和多功能酶標儀(美國Thermo)，普通離心機(德國Heraeus)，普通倒置顯微鏡(日本Nikon)，電泳儀和搖床儀(北京六一生物)。

推動黨風廉政建設與企業(yè)經營管理深度融合，切實規(guī)范國有企業(yè)領導人員廉潔從業(yè)行為，架起制度的“高壓線”，堵住國資可能的“出血點”，才能推動國有企業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及慢病毒感染 所有細胞株均培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液，細胞放在培養(yǎng)箱中(37 ℃、5%CO2)培養(yǎng)。在TFK-1和HuCCT-1細胞中分別用過表達LHPP慢病毒載體及其空白對照慢病毒載體進行感染，將細胞分為過表達LHPP組(LHPP組)和對照組(NC組)。10 mmol/L polybrene感染48 h，用2 mmol/L嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達細胞株。

1.2.2細胞增殖實驗 采用CCK-8法，分別收集2種CCA細胞的LHPP組和NC組細胞，胰酶消化并計數，按3×103個/孔細胞接種在96孔板中，每組設置5個復孔，細胞接種6 h測定為0 h的細胞活力，然后分別于24、48及72 h測定細胞活力；測定時吸出原培養(yǎng)基，向每孔中加預先配置的含CCK-8溶液110 μL(無血清RPMI-1640培養(yǎng)基 ∶CCK-8溶液=100 ∶10)，置于培養(yǎng)箱孵育2 h，于酶標儀450 nm處測量吸光度(optical density，OD)值并繪制生長曲線。

CCK-8實驗結果顯示， LHPP組TFK-1和HuCCT-1細胞于48 和72 h時OD值均較NC組減少，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

Western blot檢測結果表明， LHPP組TFK-1和HuCCT-1細胞中LHPP蛋白表達量均較NC組增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

1.3 統計學分析

1.2.4Western blot分析 收集狀態(tài)良好的各組待測細胞，RIPA裂解液于冰上裂解 30 min；超聲破碎10 s，12 000 r/min于 4℃離心10 min，收集上清蛋白液；加適量5×loading buffer于蛋白樣品中，100 ℃變性10 min；取蛋白50 μg上樣，10%丙烯酰胺凝膠經100 V恒壓電泳2 h，250 mA恒流電轉90 min，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，5%牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)溶液在常溫下封閉2 h；按目的蛋白分子量裁剪PVDF膜，并將PVDF膜置于稀釋度為 1 ∶1 000 的一抗(兔抗人GAPDH、鼠抗人AKT、兔抗人p-AKT、兔抗人P53及兔抗人LHPP單克隆抗體)中，4 ℃孵育過夜，洗滌緩沖液(tris buffered saline tween，TBST) 洗滌3次，再與相應二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，滴加超敏曝光液檢測蛋白質。

2 結果

2.1 LHPP的表達

這位來自波恩的維也納藝術家，“所有藝術都屬于他，屬于他那徹底直接的藝術作品。他是個有血有肉的人，從各方面來看都是個偉人?！钤谑郎希缃袼廊?，卻將永生?！?/p>

注：A為細胞株LHPP蛋白圖，B為LHPP相對表達量；(1)與HIBEpiC細胞比較，P<0.05。

2.2 CCA細胞中過表達LHPP

1.2.3細胞克隆 取對數生長期的各組細胞，計數調整細胞濃度，在6孔板中種植1×103個/孔細胞；待14 d后吸去皿里的培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，拍照記錄并計算各組的克隆數。

Western blot檢測結果表明，與人正常肝內膽管上皮細胞HIBEpiC相比，人CCA細胞株TFK-1、HuCCT-1細胞中LHPP蛋白表達量均下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為Western blot結果，B為LHPP相對表達量；(1)與NC組比較，P<0.05。

2.3 CCK-8實驗

在孫中山先生眼中，西南鐵路系統建設意義重大。是“西南各省全部之繁榮為最有用者也”，“種種豐富之礦產可以開發(fā)，而城鎮(zhèn)亦可于沿途建之”。但孫中山先生也看到，西南鐵路建設難度極大?！拔髂系胤?，地皆險峻?！薄按酥T地者，非山即谷。”“故建此諸鐵路之工程上困難，比之西北平原鐵路系統，乃至數倍。多數之隧道與鑿山路，須行開鑿，故建筑之費，此諸路當為中國各路之冠。”

注：A為TFK-1細胞，B為HuCCT-1細胞；(1)與同時點NC組比較，P<0.05。

2.4 細胞克隆

Western blot結果顯示，與NC組相比，LHPP組TFK-1和HuCCT-1細胞中總AKT蛋白表達無明顯改變，但p-AKT蛋白表達相對下降、P53蛋白表達則增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

注：A為細胞克隆形成，B為細胞克隆數定量表達；(1)與NC組比較，P<0.05。

2.5 AKT、p-AKT及P53蛋白的表達

克隆形成實驗結果顯示，LHPP組TFK-1和HuCCT-1細胞的克隆形成能力均較NC組降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為Western blot結果，B、C及D分別為AKT、p-AKT及P53相對表達量；(1)與NC組比較，P<0.05。

3 討論

CCA具有發(fā)病隱匿、早期診斷困難、惡性程度高及預后不良等特點，是腹腔難治性惡性腫瘤之一[9-10]。在我國，CCA患者手術切除后1、3及5年生存率僅分別為71.7%、38.2%及10.9%[11]。這意味著，探索CCA發(fā)生的新的分子機制將對CCA的臨床診斷及治療尤為重要。

在對話教學過程中，要改變傳統的教學方式。如問答式對話教學——以教師為中心和啟發(fā)式對話教學——以學生為中心，轉變?yōu)榻换ナ綄υ捊虒W——以雙主體為中心，使教師和學生之間成為一種平等的對話關系，對于知識的把握只存在時間上的差別。

LHPP基因是鹵醇脫鹵酶HAD(haloacid dehalogenas)超家族的成員之一，位于人類10號染色體(10q26.13)上，由7個外顯子編碼構成3個亮氨酸拉鏈樣結構域，能剪接產生9個轉錄變體[12]。LHPP可以有效水解焦磷酸中的氧-磷鍵、以及亞氨基二磷酸、3-磷酸組氨酸和6-磷酸賴氨酸中的氮-磷鍵，在參與調控信號轉導及細胞生長、分化等過程中發(fā)揮重要作用[4,13-15]。最近，許多獨立的全基因組關聯研究(genome wide association study，GWAS)將LHPP確定為癌癥相關風險基因，如LHPP變異體(LHPP rs201982221)是口腔癌和咽癌的新風險基因[16]，LHPP變異體(LHPP rs35837782)被認為是B細胞前體急性淋巴細胞白血病(B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia，BCP-ALL)的常見風險基因[17]，內含子LHPP單核苷酸多態(tài)性(rs61408740)被鑒定為睪丸生殖細胞腫瘤易感性相關的8個新風險基因之一[18]。另外，同樣有研究表明LHPP參與調控腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程，Hindupur 等[19]研究證明了LHPP在肝癌組織中低表達，且低LHPP表達水平也預示著腫瘤嚴重程度和總生存率降低，LHPP可能是一種新的人類抑癌因子。之后不斷有文獻報道了LHPP作為腫瘤抑制因子參與調控膀胱癌、宮頸癌、胰腺癌及腎癌等惡性腫瘤的發(fā)展過程[6-8,20]。由此可見，LHPP與腫瘤的相關性及其在腫瘤中發(fā)揮的作用值得進一步研究。

本研究結果首先表明LHPP在CCA細胞中的表達降低，通過在低表達的TFK-1和HuCCT-1細胞中過表達LHPP，CCK-8實驗結果顯示在過表達LHPP的CCA細胞中，48和72 h時所測得OD值較NC組細胞低；克隆形成實驗結果同樣顯示，在CCA細胞中過表達LHPP后，細胞的克隆形成能力減弱。這些結果提示，過表達LHPP能抑制CCA細胞的增殖能力。

AKT信號通路的級聯反應改變在癌癥細胞的增殖、凋亡及轉移等過程中發(fā)揮了重要作用，例如，AKT信號通路激活促進結直腸癌的轉移進程，而AKT通路的失活是誘導人乳腺癌細胞凋亡的關鍵[21-22]。本研究結果表明，在過表達LHPP的CCA細胞中，p-AKT蛋白表達下調，AKT蛋白表達無明顯改變，這似乎提示LHPP可能通過調節(jié)p-AKT的表達而參與調控CCA細胞的增殖作用。抑癌基因功能缺失是癌癥發(fā)生的重要機制，其中，抑癌基因P53功能缺失是人類癌癥中最常見的基因事件，P53突變是包括CCA在內的多種癌癥發(fā)生的重要過程[23-25]。本研究通過對不同組CCA細胞中P53蛋白進行檢測發(fā)現，在過表達LHPP的CCA細胞中P53蛋白表達增加，這表明，LHPP可能通過促進P53表達而發(fā)揮抑制CCA細胞的增殖作用。

綜上所述，在CCA細胞中，過表達LHPP能抑制細胞的增殖作用，其發(fā)生機制可能與下調p-AKT蛋白表達和上調P53蛋白表達有關。但本研究僅局限在體外探討了LHPP對CCA細胞的增殖作用及機制，對于在機體內復雜因素影響下，LHPP在CCA中的作用及機制仍有待進一步研究，LHPP有望成為治療CCA新的作用靶點。