宋春灼， 李想， 李俊俊， 劉猛， 付立躍， 朱海濤*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科, 貴州 貴陽(yáng) 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550004)

胰腺癌是一種惡性程度極高的腫瘤，患者的5年生存率低于5%[1-2]。胰腺癌患者的預(yù)后差的原因部分歸因于局部腫瘤侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤的極端耐藥等[3]。吉西他濱(gemcitabine，GEM)是目前胰腺癌化療“金標(biāo)準(zhǔn)”中的首選藥物之一[4]， 但晚期胰腺癌患者在治療過(guò)程中極易對(duì)GEM產(chǎn)生耐藥，單用GEM在臨床治療中的效果并不理想，患者的中位生存期僅約4～6個(gè)月[5-6]。因此，尋找新的藥物聯(lián)合GEM應(yīng)用在胰腺癌的臨床治療中非常重要。近年來(lái)，隨著對(duì)中藥研究的不斷加深，已發(fā)現(xiàn)大黃素、苦參堿等對(duì)胰腺癌具有抗腫瘤作用[7-8]。黃連素(berberine，BBR)又名小柴堿，是從黃連、黃柏等植物中提取的一種藥用價(jià)值很高的化合物，具有抗炎、降脂、降糖以及抗氧化等多種藥理作用[9-12]；有報(bào)道黃連素被用于肺癌、胃癌、大腸癌等多種惡性腫瘤中，且具有抗腫瘤作用[13-15]，張勁等[16]研究表明黃連素通過(guò)增加Caspase-3表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡。因此，本研究將BBR以及BBR聯(lián)合GEM作用于胰腺癌PANC-1細(xì)胞，觀察兩種用藥方式在體外對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑及儀器 GEM(美國(guó)Selleck Chemicals公司)、BBR(美國(guó)Sigma公司)、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶溶液(美國(guó)Gibco公司)、胎牛血清(以色列Biological Industries公司)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO，美國(guó)Hycione公司)、CCK-8細(xì)胞毒性試劑盒(上海Dojido)、細(xì)胞裂解液、4%多聚甲醛、0.01%結(jié)晶紫(廣州Affinity)；兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、兔抗人B細(xì)胞白血病/淋巴瘤2凋亡調(diào)節(jié)因子(Bcl-2)單克隆抗體、兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白X(BAX)單克隆抗體(武漢Proteintech Group)、山羊抗兔二抗(武漢Boster)，371型恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配置 人胰腺癌PANC-1細(xì)胞在含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于 37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，細(xì)胞融合度達(dá)90% 時(shí)進(jìn)行傳代處理，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。BBR和GEM均用 DMSO 配制成 10 mol/L的母液放置于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存，用時(shí)以DMEN高糖培養(yǎng)基稀釋成各個(gè)濃度的工作液使用。

1.2.2篩選最佳藥物濃度 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，用胰酶消化制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)；于96孔板中每孔種植 5×103個(gè)細(xì)胞，每組5個(gè)復(fù)孔，另設(shè)一組只加DMEM高糖培養(yǎng)基作為調(diào)零組。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為對(duì)照1組(未處理)、12.5 μmol/L BBR組、25.0 μmol/L BBR組以及50.0 μmol/L BBR組，48 h后吸去培養(yǎng)基，向每孔中加入配置好的含CCK-8的溶液110 μL(DMEM培養(yǎng)基 ∶CCK-8溶液=100 ∶10),在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下讀取各孔吸光度值(optical density,OD值)，并計(jì)算各組細(xì)胞的抑制率及藥物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。細(xì)胞抑制率(%)=[(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值) / (對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值) ]×100%，藥物對(duì)PANC-1細(xì)胞的IC50是在GraphPad 8.3軟件中通過(guò)藥物各濃度對(duì)細(xì)胞的抑制率構(gòu)建非線性回歸函數(shù)公式得出。在研究GEM單藥作用時(shí)，細(xì)胞貼壁后，以0.0、0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L的GEM處理細(xì)胞48 h，后續(xù)操作同黃連素單藥應(yīng)用。在研究BBR聯(lián)合GEM作用時(shí)，根據(jù)BBR藥物對(duì)PANC-1細(xì)胞的IC50，選取25.0 μmol/L BBR進(jìn)行聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)；細(xì)胞貼壁后，以0.0、0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L GEM聯(lián)合25.0 μmol/L BBR處理細(xì)胞48 h，后續(xù)操作同上。應(yīng)用金氏計(jì)算公式計(jì)算藥物協(xié)同指數(shù)(q值)，q=EA+B/[EA+(1-EA)×EB]，其中EA、EB分別表示A藥物和B藥物單獨(dú)使用時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制率，EA+B表示A藥物和B藥物聯(lián)合使用時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制率。q>1.15時(shí)表示藥物存在協(xié)同效應(yīng)。根據(jù)計(jì)算的q值選擇協(xié)同抑制效果最佳的藥物濃度組合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3分組 根據(jù)GEM和BBR對(duì)PANC-1細(xì)胞的IC50值以及各藥物濃度組合的q值，將細(xì)胞分為對(duì)照2組(未處理)、GEM組(1.0 μmol/L GEM)、BBR組(25.0 μmol/L BBR)以及聯(lián)合組(25.0 μmol/L BBR聯(lián)合1.0 μmol/L GEM)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1細(xì)胞克隆形成數(shù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 PANC-1 細(xì)胞，胰酶消化制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，在 6孔板中每孔種值1×103個(gè)細(xì)胞；細(xì)胞貼壁之后，按上述分組處理PANC-1細(xì)胞，待 12 d后吸去皿里的培養(yǎng)基，用4%的多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，烘干，拍照并計(jì)算各組細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.3.2Bcl-2和BAX蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用含苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)蛋白酶抑制劑的細(xì)胞蛋白裂解液裂解30 min，超聲破碎10 s，以12 000 r/min在4 ℃下離心10 min，收集上清蛋白液；在蛋白液中加適量 5×loading buff在100 ℃下變性10 min；取50 μg 蛋白上樣，用10%的丙烯酰胺凝膠經(jīng)100 V恒定電壓電泳2 h、250 mA 恒定電流轉(zhuǎn)膜90 min至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，用含5%的脫脂奶粉在常溫下封閉 2 h；分別加入稀釋度為 1 ∶1 000 的Bcl-2、BAX和GAPDH一抗，4 ℃過(guò)夜后，洗滌緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)洗滌 3 次，加入稀釋度為1 ∶5 000 二抗室溫孵育 2 h，滴加高敏曝光液在 Bio-rad成像系統(tǒng)中曝光。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 最佳藥物濃度

CCK-8結(jié)果顯示，BBR在PANC-1細(xì)胞中的IC50為39.92 μmol/L(圖1A)，GEM對(duì)PANC-1細(xì)胞IC50為29.07 μmol/L；25.0 μmol/L BBR聯(lián)合不同濃度GEM作用時(shí)，其對(duì)PANC-1細(xì)胞IC50為1.604 μmol/L。通過(guò)金氏公式計(jì)算得出，25.0 μmol/L BBR聯(lián)合GEM(0.1、1、10、100 μmol/L)共同作用時(shí)，q值分別為1.08、1.42、1.26、1.18，見(jiàn)圖1B。其中，25.0 μmol/L BBR聯(lián)合1.0 μmol/L GEM作用時(shí)協(xié)同抑制效果最佳，此聯(lián)合濃度用于后續(xù)研究。

注：A為BBR單藥對(duì)細(xì)胞的抑制率，B為GEM單藥或聯(lián)合BBR對(duì)細(xì)胞的抑制率。

2.2 克隆形成數(shù)

克隆形成數(shù)研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著BBR濃度增加，細(xì)胞克隆數(shù)形成逐漸減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2A、圖2B。與對(duì)照組相比，GEM組、BBR組和聯(lián)合組的PANC-1細(xì)胞克隆形成數(shù)均減少，且聯(lián)合組細(xì)胞克隆形成減少較GEM組和BBR組更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2C、圖2D。

2.3 PANC-1細(xì)胞中Bcl-2和BAX蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，隨著BBR濃度的增加，Bcl-2表達(dá)逐漸降低， BAX表達(dá)逐漸增加(P<0.05)，見(jiàn)圖3A～圖3C。與對(duì)照組相比，GEM組、BBR組和聯(lián)合組細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)降低，BAX表達(dá)增加，且聯(lián)合組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)降低及BAX蛋白表達(dá)增加較GEM組和BBR組均更明顯(P<0.05)，見(jiàn)圖3D～圖3F。

注：A為不同濃度BBR處理的細(xì)胞蛋白結(jié)果，B為Bcl-2相對(duì)表達(dá)量，C為BAX相對(duì)表達(dá)量，D為BBR、GEM及聯(lián)合用藥處理的細(xì)胞蛋白結(jié)果，E為Bcl-2相對(duì)表達(dá)量，F(xiàn)為BAX相對(duì)表達(dá)量；(1)與對(duì)照1組或2組比較，P<0.05；(2)與聯(lián)合組比較，P<0.05。

3 討論

對(duì)于不能進(jìn)行手術(shù)切除治療的晚期胰腺癌患者，化療發(fā)揮了極其重要的作用。GEM作為目前晚期胰腺癌治療的一線化療藥物，主要作用于細(xì)胞分裂的G1/S期，通過(guò)抑制DNA合成、修復(fù)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤的作用[17-19]。然而，胰腺癌的發(fā)展是一個(gè)建立在遺傳和表觀改變基礎(chǔ)上的多步驟過(guò)程，隨著疾病不斷發(fā)展，晚期胰腺癌患者即使采用全身性支持治療，效果仍不理想，且患者在治療后期可能會(huì)出現(xiàn)對(duì)GEM耐藥的情況[20]。因此，目前臨床治療晚期胰腺癌患者的主要策略是將GEM與其他細(xì)胞毒性藥物或靶向藥物聯(lián)用，以降低患者對(duì)GEM耐藥的發(fā)生[21-23]。這意味著尋找一種或多種新的藥物聯(lián)合GEM應(yīng)用尤為重要。

BBR在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用，其抗腫瘤機(jī)制包括調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖及增強(qiáng)藥物敏感性等[24]。在本實(shí)驗(yàn)中，重點(diǎn)研究應(yīng)用BBR單藥以及聯(lián)合GEM應(yīng)用對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，用不同濃度BBR(12.5、25.0、50.0 μmol/L)在體外作用于人胰腺癌PANC-1細(xì)胞，CCK-8、克隆形成等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BBR能抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，且抑制細(xì)胞增殖的能力與劑量呈依賴關(guān)系；接下來(lái)，本實(shí)驗(yàn)還探究了在胰腺癌中BBR與GEM聯(lián)用的可能性，通過(guò)計(jì)算BBR單藥應(yīng)用在PANC-1細(xì)胞中的IC50值，選取25.0 μmol/L BBR與不同濃度GEM聯(lián)合應(yīng)用，并通過(guò)金氏公式計(jì)算得出，25.0 μmol/L BBR聯(lián)合GEM(1.0、10.0、100.0 μmol/L)時(shí)均發(fā)揮協(xié)同作用抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，且在25.0 μmol/L BBR聯(lián)合1.0 μmol/L GEM時(shí)協(xié)同作用最佳。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡過(guò)程，主要受以Bcl-2家族和caspase3家族為主的多基因調(diào)控[25-26]。Bcl-2 和BAX是Bcl-2家族的成員，主要通過(guò)改變線粒體膜上電位，釋放下游相關(guān)促凋亡因子，促發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27-28]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GEM能通過(guò)上調(diào)BAX蛋白表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡[29]。李舒等[30]研究表明，BBR能通過(guò)下調(diào)Bcl-2及上調(diào)BAX蛋白表達(dá)促進(jìn)人胃癌細(xì)胞SGC7901的凋亡。因此，本研究檢測(cè)不同處理組PANC-1細(xì)胞中Bcl-2及BAX蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明，BBR聯(lián)合GEM能顯著下調(diào)細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)及上調(diào)BAX蛋白表達(dá)，提示BBR聯(lián)合GEM作用可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞中Bcl-2及BAX蛋白表達(dá)，從而誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，BBR能抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，且與GEM聯(lián)用能發(fā)揮協(xié)同作用，能增強(qiáng)GEM單藥應(yīng)用的敏感性，使抑制細(xì)胞增殖和誘發(fā)細(xì)胞凋亡的能力增強(qiáng)。BBR有望成為GEM治療胰腺癌的有效聯(lián)合藥物之一。