陳忠彪，周大臣，侯 輝，張 彬

(安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院膽外胰外科一病區(qū)，安徽 合肥 230601)

肝細胞性肝癌(hepatocarcinoma，HCC)是全世界第四大癌癥死亡原因。2018年，全球約有84.1萬例HCC新發(fā)病例，78.2萬例死亡病例[1-2]。目前腫瘤切除是HCC治療最有效的方法之一，但其術(shù)后復發(fā)率較高，5 a無病生存率僅為20%[3]。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)是一類在表型上和功能上與眾不同的T細胞亞群，可調(diào)節(jié)免疫反應使機體保持免疫狀態(tài)的平衡[4-5]。Treg細胞的消耗可增強腫瘤細胞耐受機體免疫的能力，并抑制腫瘤生長[6]。有研究顯示，HCC患者循環(huán)血液系統(tǒng)和腫瘤浸潤微環(huán)境中Treg的比例顯著高于健康人群，而且Treg被優(yōu)先富集在HCC患者外周血、腫瘤組織及癌旁組織并不斷克隆增殖[7-8]。有研究報道，體外誘導Treg細胞可以促進HCC細胞的生長、克隆，并促進肝癌細胞對索拉菲尼耐藥性的形成[9]。CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞是Treg中具有免疫抑制能力的T細胞亞群，可抑制效應T細胞，幫助腫瘤逃脫免疫監(jiān)視[6]。CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞占CD4+T淋巴細胞百分比(CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞)增高對自身免疫性疾病和變態(tài)反應的治療以及預防同種異體移植排斥反應有益。因此，本研究以CD127low作為Treg細胞的篩選標志物，觀察HCC患者外周血CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞的變化，分析其增高的影響因素，以期得到HCC患者腫瘤免疫逃逸的影響因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年8月至2020年5月安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院肝膽外科收治的103例HCC患者為研究對象，其中男86例，女17例；年齡22～86(59.00±11.7)歲。所有患者經(jīng)影像學及病理學檢查確診為HCC,術(shù)前未行放射治療、化學治療及動脈栓塞治療，且無其他基礎(chǔ)疾病及腫瘤。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器淋巴細胞分離液購自天津市灝洋科技生物有限公司，CD3-藻紅蛋白-花青苷5(phycoerythrin cyanin 5，PC5)、CD3-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)購自天津協(xié)科生物技術(shù)有限公司，CD4-PC5、CD4-FITC、CD19-FITC、CD20-藻紅蛋白(P-phycoerythrin,PE)、CD25-FITC購自美國Introgen公司，CD45-PC5、CD127-PE購自美國eBioscience公司，紅細胞裂解緩沖液、細胞染色緩沖液購自美國珀金埃爾默公司，磷酸鹽緩沖液購自美國Gibco公司；高速低溫離心機購自美國Eppendorf公司，CytoFlex流式細胞儀購自美國BD公司，渦旋振蕩器購自上海生物工程股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集(1)一般資料：包括性別、年齡、體質(zhì)量、高血壓及糖尿病等；(2)既往病史：包括腹部手術(shù)史、感染病史、免疫治療史等；(3)治療前實驗室檢查：包括血常規(guī)、肝功能、凝血功能、乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)及甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)等；(4)術(shù)后患者腫瘤病理情況：包括肝硬化、包膜完整性、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、血管侵犯及門靜脈栓子等。

1.3.2 外周血免疫細胞亞群測定HCC患者于入院治療前抽取清晨空腹肘靜脈血24 mL，乙二胺四乙酸三鉀抗凝；分別取2個測定管用作Treg、T細胞亞群測定管，Treg測定管中加入CD25-FITC、CD4-PC5、CD127-PE各2.5 μL，T細胞亞群測定管中加入CD4-FITC、CD8-PE、CD3-PC5 各2.5 μL和CD45-PC7 1.0 μL；然后，各測定管內(nèi)分別加入全血50 μL，振蕩混勻，室溫避光標記15 min；加入500 μL溶血劑，振蕩混勻，室溫避光溶血10 min。2 000 r·min-1離心2 min，棄上清液，加鞘液500 μL，2 000 r·min-1離心2 min，棄上清液，加入鞘液500 μL,充分混勻，應用CytoFlex流式細胞儀檢測免疫細胞，CytExpert軟件分析CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞值。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者外周血CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞檢測結(jié)果結(jié)果見圖1。基于健康人群外周血CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞參考值 4.29%～6.17%，82例HCC患者的CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞<6.17%(正常組)，21例HCC患者的CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞≥6.17%(異常增高組)。

A：HCC患者外周血CD4+CD25+CD127low T淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高;B：HCC患者外周血CD4+CD25+CD127low T淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞正常。

2.2 HCC患者外周血CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高的危險因素單因素分析結(jié)果見表1。CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高與AFP有關(guān)(P<0.05)，與HbsAg、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)-DNA、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、肝硬化、門靜脈癌栓等因素無關(guān)(P>0.05)。

表1 HCC患者外周血CD4+CD25+CD127low T淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高的危險因素單因素分析

2.3 HCC患者CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高多因素logistic回歸分析結(jié)果見表2。將單因素分析中P<0.2的因素納入多因素分析中，結(jié)果顯示，CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高與AFP陰性、肝硬化、多發(fā)腫瘤有關(guān)(P<0.05)。

表2 HCC患者外周血CD4+CD25+CD127low T淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高多因素logistic回歸分析

2.4 Nomogram 臨床預測模型建立結(jié)果見圖2。Nomgram圖顯示，腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤多發(fā)、合并肝硬化、伴有HBV-DNA<1 000 IU·mL-1、術(shù)前抗病毒治療干預的HCC患者血清CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高的概率增大；而HCC患者AFP陽性，其CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞增高的概率小。

圖2 預測HCC患者外周血CD4+CD25+CD127low T淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高的危險因素Nomogram模型圖

3 討論

HCC是肝癌最常見的一種臨床亞型，我國HCC發(fā)病人數(shù)約占全球新發(fā)病例的55%，所導致的疾病負擔呈上升趨勢[11]。HCC預后較差，5 a生存率較低，早期發(fā)現(xiàn)并及時給予治療可提高患者生存率。目前，HCC最有效的治療方式為手術(shù)完整切除，但術(shù)后常發(fā)生癌細胞轉(zhuǎn)移，而癌細胞轉(zhuǎn)移與HCC患者的自身免疫狀態(tài)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞可以逃避機體對腫瘤的免疫監(jiān)視，從而發(fā)生癌細胞的轉(zhuǎn)移[12]。

Treg幾乎參與機體所有類型的免疫反應，其在腫瘤患者體內(nèi)可抑制針對腫瘤的免疫反應，從而幫助腫瘤細胞躲避機體的免疫監(jiān)視。肝臟本身是免疫器官，HCC為炎癥相關(guān)腫瘤，因此，CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，抑制體內(nèi)Treg增高可以改善HCC患者的免疫狀態(tài)[13]。有研究報道，HCC患者體內(nèi)Treg的數(shù)量可影響抗體的免疫狀態(tài)，伴Treg浸潤的接受肝切除術(shù)的HCC患者具有較高的復發(fā)率，預后更差[14]。研究發(fā)現(xiàn)，HCC腫瘤微環(huán)境中CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞的增加與腫瘤大小和血管侵犯相關(guān)[7]。本研究結(jié)果顯示，21例(79.6%)HCC患者血清中CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高；單因素分析結(jié)果顯示，HCC患者血清中CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高與AFP相關(guān)，與HbsAg、HBV-DNA、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、肝硬化、門靜脈癌栓等因素無關(guān)；多因素分析結(jié)果顯示，CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高與AFP陰性、肝硬化、多發(fā)腫瘤相關(guān)。究其原因，可能與AFP的分子作用及肝硬化的發(fā)生機制相關(guān)，AFP能夠降低巨噬細胞吞噬活性，刺激Treg的增殖，并誘導T細胞活性的調(diào)節(jié)。LU等[15]研究發(fā)現(xiàn)，樹突細胞衍生的外泌體內(nèi)富含大量AFP，而AFP可引發(fā)Treg減少進而導致小鼠的肝癌細胞生長遲緩；而在肝硬化患者中，Treg的數(shù)量明顯增加，Treg可以抑制肝星狀細胞的NK細胞脫顆粒，損害NK細胞的抗纖維化功能，促進肝硬化的進展[16]；SOLDEVILA等[14]研究也證實，HCC患者體內(nèi)Treg顯著增加，但其增加機制尚不明確。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高與肝硬化有關(guān)。

本研究臨床預測模型Nomogram圖顯示，HBV-DNA<1 000 IU·mL-1、術(shù)前抗病毒治療的HCC患者外周血CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高的可能性越大，而SOLDEVILA等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染患者抗病毒治療后其體內(nèi)CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞數(shù)量明顯減少；而大量研究報道，HCC患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg數(shù)量高于正常人群，產(chǎn)生這種差異的原因可能是腫瘤刺激了CD4+CD25+CD127low T淋巴細胞增加，而這種刺激超過了抗病毒后CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞的減少[6-9]。另外，臨床預測模型Nomogram圖還顯示，腫瘤多發(fā)、腫瘤直徑≥5 cm的HCC患者體內(nèi)CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高的概率增大。已有研究證實，Treg數(shù)目與HCC患者預后呈負相關(guān)，且單發(fā)腫瘤、腫瘤直徑越小的患者預后越好[10，17]。因此，在手術(shù)無法切除腫瘤或者針對HCC患者術(shù)后生存期無法達到預期時，在術(shù)前或免疫治療前通過采用分子靶向治療、射頻消融治療等降低HCC患者荷瘤數(shù)目及腫瘤直徑，以調(diào)整機體免疫狀態(tài)，可更好地延長患者的生存期及提高患者的生活質(zhì)量；通過檢測CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞也可以對治療方式及治療價值進行評估。

綜上所述，HCC患者外周血中CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞發(fā)揮著免疫抑制作用，而HCC患者人群中僅有一部分患者外周血CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高，且AFP陰性、腫瘤單發(fā)、肝硬化是HCC患者外周血CD4+CD25+CD127lowT淋巴細胞/CD4+T淋巴細胞異常增高的危險因素，但這是否影響HCC患者的預后還需要進一步的隨訪證實。