谷曉源，車祥源，馬 靜，宋凈洋，邢紅霞，李超堃

(1.河南省神經(jīng)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 衛(wèi)輝 453100；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003；4.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)變性疾病，以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性缺失和路易小體形成為病理特征[1]。氧化應(yīng)激和線粒體功能缺陷，特別是復(fù)合物I活性下降是PD發(fā)病機(jī)制的核心[2-3]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活劑-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC-1α)是參與細(xì)胞能量代謝和線粒體生物合成的許多基因的重要輔助活化因子，通過(guò)參與調(diào)節(jié)線粒體能量代謝來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4-5]。此外，細(xì)胞內(nèi)需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系來(lái)保證健康的線粒體網(wǎng)絡(luò)以維持線粒體穩(wěn)態(tài)。PGC-1α表達(dá)上調(diào)可以調(diào)節(jié)線粒體質(zhì)量控制，以防止線粒體功能障礙，如亨廷頓病、阿爾茨海默病和PD[6]。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)誘導(dǎo)的PD小鼠模型中，PGC-1α基因敲除小鼠黑質(zhì)中酪氨酸羥化酶陽(yáng)性神經(jīng)元丟失達(dá)61%，而野生型僅丟失12%[7]。PGC-1α基因在PD的發(fā)生中起重要作用，是PD候選易感基因。目前，關(guān)于PGC-1α 基因多態(tài)性與PD發(fā)生的相關(guān)性尚無(wú)相關(guān)研究。有研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α rs2946385基因多態(tài)性與2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)的發(fā)生顯著相關(guān)[8]。而T2DM和PD患者存在相同的通路損害，如超過(guò)60%的PD患者胰島素信號(hào)受損且出現(xiàn)糖耐量受損，在約62%的PD癡呆患者中發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗，且其中30%的人對(duì)葡萄糖不耐受[9]。與不合并糖尿病的PD患者相比，合并糖尿病的PD患者的統(tǒng)一帕金森病評(píng)定量表第三部分(unified Parkinson′s disease rating scale part Ⅲ，UPDRS-Ⅲ)運(yùn)動(dòng)評(píng)分、腦脊液tau蛋白水平較高，紋狀體多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合水平較低[10]。以上研究提示PGC-1α rs2946385基因多態(tài)性與PD的發(fā)生可能存在相關(guān)性?；诖?，本研究探討了PGC-1α rs2946385 基因多態(tài)性與PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年3月至2019年12月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及住院診斷為PD的86例患者(PD組)為研究對(duì)象?；颊呔嫌?guó)帕金森病腦庫(kù)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有精神疾病及家族史者；(2)糖尿病、軀體障礙疾?。?3)各種原因引起的帕金森綜合征和帕金森疊加綜合征；(4)腦血管疾病史、顱腦外傷史。由2名神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師進(jìn)行臨床信息收集并行頭顱CT或核磁共振成像檢查排除以上疾病。采用漢密爾頓抑郁量表(hamilton depression scale,HAMD)、漢密爾頓焦慮量表(hamilton anxiety scale,HAMA)、UPDRS-Ⅲ運(yùn)動(dòng)評(píng)分、簡(jiǎn)易精神狀態(tài)評(píng)價(jià)量表(mini-mental state exam,MMSE)及蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(Montreal cognitive assessment,MoCA)分別來(lái)評(píng)估PD患者的抑郁狀態(tài)、焦慮狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)功能及認(rèn)知功能。MMSE量表得分<27分為認(rèn)知功能下降，MOCA 量表得分<26分為認(rèn)知功能下降，HAMD量表得分>17 分表示存在抑郁，HAMA量表得分>14分表示合并焦慮。根據(jù)PD患者運(yùn)動(dòng)癥狀和UPDRS-Ⅲ評(píng)分，依據(jù)KANG等[12]提出的分型方法將PD患者分為強(qiáng)直少動(dòng)型(rigidity dominant PD,AR-PD)組(n=44)和震顫為主型(tremor dominant PD,TD-PD)組(n=42)。另選擇性別、年齡與PD組匹配的健康體檢者86例作為對(duì)照組。PD組：男44例，女42例；年齡40～83(60.27±8.12)歲；病程1～10(3.33±1.94)a；認(rèn)知功能正常24例，認(rèn)知功能下降62例；合并焦慮19例，不合并焦慮67例。對(duì)照組：男45例，女41例；年齡42～79(60.29±8.66)歲。2組受試者的性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。AR-PD組：男23例，女21例；年齡40～82(60.09±8.77)歲；病程1～10(3.45±1.95)a；認(rèn)知功能正常11例，認(rèn)知功能下降33例；合并焦慮13例，不合并焦慮31例。TD-PD組：男21例，女21例；年齡40～83(60.45±70.47)歲；病程1～10(3.19±1.95)a;認(rèn)知功能正常20例，認(rèn)知功能下降22例；合并焦慮6例，不合并焦慮36例。本研究通過(guò)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有入組對(duì)象提前被告知本研究的目的，并簽署相關(guān)知情同意書(shū)。

1.2 rs2946385 基因多態(tài)性檢測(cè)

1.2.1 全基因組提取所有受試者抽取清晨空腹肘靜脈血4 mL，置于乙二胺四乙酸二鈉抗凝管中，嚴(yán)格按照血液DNA提取試劑盒的說(shuō)明操作取全基因組，采用WD9409B紫外分析儀檢測(cè) DNA的濃度及純度，放入-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 rs2946385位點(diǎn)引物的設(shè)計(jì)與合成依據(jù)美國(guó)國(guó)家生物信息中心PGC-1α基因序列設(shè)計(jì)，在基因組找到rs2946385基因位點(diǎn)，采用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo Analyzer設(shè)計(jì)引物，由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成。該位點(diǎn)上游引物序列為5′-TCCTATCACATGCTATTGCAG-3′，下游引物序列為5′-GGGAAATAGACAGGAATAAACAGG-3′。

1.2.3 rs2946385基因片段獲取應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)進(jìn)行目的基因片段的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：模板DNA 1 μL，雙蒸水21 μL，2×Taq PCR Mix 25 μL，上、下游引物各1.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃終末延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL PCR產(chǎn)物，加入1 μL核酸染料染色，混勻，在170 V恒壓下使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳12 min左右，然后使用XRS+型凝膠成像儀確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序選取可以擴(kuò)增出rs2946385基因片段的PCR產(chǎn)物，將該產(chǎn)物送至武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN8軟件進(jìn)行比對(duì)分析，使用Chromas軟件讀取測(cè)序峰圖，對(duì)PD組和對(duì)照組rs2946385位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。

2 結(jié)果

2.1 受試者非運(yùn)動(dòng)癥狀比較結(jié)果見(jiàn)表1和表2。PD組患者中認(rèn)知功能下降、焦慮、抑郁患者所占比例顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AR-PD組與TD-PD組患者中焦慮、抑郁患者所占比例比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AR-PD組患者中認(rèn)知功能下降患者所占比例顯著高于TD-PD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 PD組與對(duì)照組受試者非運(yùn)動(dòng)癥狀比較

表2 AR-PD組與TD-PD組受試者非運(yùn)動(dòng)癥狀比較

2.2 rs2946385 基因型和等位基因在PD及其亞型中的分布結(jié)果見(jiàn)圖1和表3。rs2946385位點(diǎn)基因型有AA、CA、CC 3種，PD組和對(duì)照組基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。PD組患者CC基因型、等位基因C頻率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AR-PD組患者CC基因型、等位基因C頻率與TD-PD組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組受試者rs2946385 基因型和等位基因頻率的比較

注：rs2946385位點(diǎn) C>A，分CC、CA、AA 3種基因型。

2.3 rs2946385 基因型和等位基因與PD患者焦慮、認(rèn)知的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果見(jiàn)表4和表5。PD組中合并焦慮與不合并焦慮患者的基因型和等位基因分布比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TD-PD組合并焦慮與不合并焦慮患者的基因型和等位基因分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AR-PD組合并焦慮患者中基因型CC患者所占比例及等位基因C頻率顯著低于不合并焦慮患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 PD組中焦慮與非焦慮受試者rs2946385 基因型和等位基因頻率比較

表5 PD組患者中認(rèn)知功能正常與認(rèn)知功能下降患者rs2946385 基因型和等位基因頻率比較

PD組、TD-PD組、AR-PD組合并認(rèn)知功能下降與不合并認(rèn)知功能下降患者的基因型和等位基因分布比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 影響AR-PD患者并發(fā)焦慮的因素logistic回歸分析結(jié)果見(jiàn)表6。年齡、性別、病程、PGC-1α rs2946385不是AR-PD合并焦慮的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P>0.05)，UPDRS-Ⅲ評(píng)分的嚴(yán)重程度是AR-PD合并焦慮的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。調(diào)整性別、年齡、病程、UPDRS-Ⅲ評(píng)分等危險(xiǎn)因素后，PGC-1α rs2946385與AR-PD組患者合并焦慮仍無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

表6 AR-PD并發(fā)焦慮的危險(xiǎn)因素logistic回歸分析

3 討論

PD是一種進(jìn)展性神經(jīng)退行性疾病，有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激與PD密切相關(guān)[1]。PD患者死后腦組織尸檢結(jié)果[13]、MPTP和魚(yú)藤酮應(yīng)用于 PD的動(dòng)物和細(xì)胞模型[14-15]均表明線粒體功能障礙與散發(fā)性PD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。PGC-1α基因可以挽救MPTP誘導(dǎo)的C57BL小鼠線粒體功能障礙[16]，PGC-1α在PD的發(fā)病中起保護(hù)作用。

T2DM患者發(fā)生PD的概率顯著升高，T2DM和PD的發(fā)病可能存在共同的遺傳傾向和(或)共同的致病途徑[8]。PGC-1α是PD發(fā)病中的重要調(diào)節(jié)因子，因此，本研究觀察了PGC-1α rs2946385位點(diǎn)突變率與PD的發(fā)生是否相關(guān)。本研究中，對(duì)照組和PD組受試者PGC-1α rs2946385位點(diǎn)突變的頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也未觀察到PGC-1α rs2946385位點(diǎn)與AR-PD、TD-PD患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。據(jù)此推斷，PGC-1α rs2946385基因多態(tài)性可能不是T2MD與PD的共同致病原因，PGC-1α rs2946385基因多態(tài)性可能不是PD發(fā)病的危險(xiǎn)因素。本研究未納入合并糖尿病的PD患者，PGC-1α rs2946385位點(diǎn)突變陽(yáng)性與PD合并糖尿病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)尚不清楚，今后的研究將會(huì)對(duì)此進(jìn)一步探討。既往有研究報(bào)道，PGC-1α是焦慮相關(guān)疾病的潛在易感基因[17]。LEONE等[18]在PGC-1α基因缺陷小鼠中觀察到焦慮樣行為的增加。而在SZALARDY等[19]的研究中并未觀察到PGC-1α基因缺陷小鼠焦慮行為的增加，相反這些動(dòng)物尤其是雄性動(dòng)物的焦慮相關(guān)行為顯著降低[19]。基于以上不同觀點(diǎn)，本研究也觀察了PGC-1α rs2946385基因多態(tài)性與PD非運(yùn)動(dòng)癥狀焦慮發(fā)生的相關(guān)性，結(jié)果顯示，PD組、TD-PD組中PGC-1α rs2946385基因多態(tài)性與受試者合并焦慮的發(fā)生沒(méi)有關(guān)聯(lián)，而AR-PD組患者中PGC-1α rs2946385基因型CC、等位基因C頻率與受試者合并焦慮的發(fā)生有關(guān)，但logistic回歸分析結(jié)果顯示，PGC-1α rs2946385基因多態(tài)性并不是AR-PD患者合并焦慮的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這可能與本研究的樣本量不夠足、入選研究對(duì)象限定為豫北地區(qū)人群有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)癥狀越嚴(yán)重，AR-PD組患者合并焦慮的風(fēng)險(xiǎn)越大，這與萬(wàn)志榮等[20]研究結(jié)果一致。既往研究多關(guān)注在PD合并抑郁方面，對(duì)并發(fā)焦慮的關(guān)注度不高，針對(duì)UPDRSⅢ評(píng)分、PGC-1α rs2946385基因多態(tài)性與PD亞型合并焦慮的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，PD患者的首發(fā)癥狀中，以震顫為首發(fā)癥狀的患者發(fā)生認(rèn)知功能障礙的比例要較以肌強(qiáng)直為首發(fā)癥狀的患者少[21]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，AR-PD組中認(rèn)知功能下降患者所占比例顯著高于TD-PD組。而PGC-1α rs2946385基因多態(tài)性與PD及AR-PD和TD-PD 2種亞型組受試者是否合并認(rèn)知功能下降無(wú)關(guān)，PGC-1α rs2946385位點(diǎn)突變不是PD并發(fā)認(rèn)知功能下降的危險(xiǎn)因素。國(guó)外有研究報(bào)道，TD-PD亞型PD患者合并抑郁的發(fā)病率隨病情進(jìn)展而降低[22]。本研究未觀察到該現(xiàn)象，TD-PD組與AR-PD組中合并抑郁患者的比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與樣本量、地區(qū)差異、受教育程度等多種因素有關(guān)。

綜上所述，AR-PD型患者的認(rèn)知功能下降較TD-PD型患者更明顯。UPDRSⅢ評(píng)分越高，AR-PD型患者合并焦慮的風(fēng)險(xiǎn)越大。盡管在本研究中并未發(fā)現(xiàn)PGC-1α rs2946385基因多態(tài)性與PD、TD-PD型、AR-PD型患者焦慮、認(rèn)知功能下降的發(fā)生存在相關(guān)性，但該研究結(jié)果是中國(guó)PD人群遺傳學(xué)的重要補(bǔ)充。PGC-1α rs2946385基因多態(tài)性與PD的相關(guān)性尚需多中心、大樣本研究來(lái)驗(yàn)證。