河春姬 申利

1 北京體育大學(xué)（北京100084）

2 國家體育總局反興奮劑中心（北京100029）

生長激素（growth hormone，GH）和胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-Ⅰ）因具有蛋白同化作用，被列入世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（World Anti-Doping Agency，WADA）禁用清單[1]。WADA頒布的體育項(xiàng)目特殊檢測技術(shù)文件（technical document for sport specific analysis，TDSSA）[2]明確了GH 將作為運(yùn)動員生物護(hù)照（athlete biological passport ，ABP）內(nèi)分泌模塊的檢測項(xiàng)目，IGF-Ⅰ作為GH 檢測的一個重要間接指標(biāo)，成為ABP 內(nèi)分泌模塊的檢測指標(biāo)之一被長期監(jiān)測。目前對IGF-Ⅰ的檢測，普遍采用WADA實(shí)驗(yàn)室生長激素間接法指南（laboratory guidelines human growth hormone（hGH）biomarkers test，GH Biomark?ers）[3]指定的酶免化學(xué)發(fā)光自動檢測平臺系統(tǒng)。但由于檢測過程自動化和商品化程度較高，一旦國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)發(fā)生更迭，而生產(chǎn)廠家不能及時(shí)推出替換產(chǎn)品，原有檢測系統(tǒng)將無法繼續(xù)使用，既易造成巨大浪費(fèi)，又影響該項(xiàng)目興奮劑檢測的持續(xù)開展。

質(zhì)譜方法檢測因其指紋式識別特性一直是反興奮劑研究中的重要檢測手段。指紋式識別，即將待測樣品與已知標(biāo)準(zhǔn)品的特征離子（對）質(zhì)荷比進(jìn)行對照來確認(rèn)樣品中是否存在該物質(zhì)。近些年來隨著儀器檢測技術(shù)的不斷革新，質(zhì)譜法檢測肽類物質(zhì)的研究和應(yīng)用也不斷增多。由于質(zhì)譜方法可用于多種物質(zhì)的檢測，降低單個物質(zhì)的檢測成本，同時(shí)檢測方案更加靈活，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，更適合作為興奮劑常規(guī)檢測方法進(jìn)行開發(fā)和應(yīng)用，其中三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用（ liquid chro?matography triple-quadrupole mass spectrometry，LCQQQ）技術(shù)是目前廣泛采用的定量檢測生物大分子的技術(shù)之一。

興奮劑IGF-Ⅰ的質(zhì)譜檢測方法國內(nèi)尚無報(bào)道。國際興奮劑檢測領(lǐng)域?qū)τ贗GF-Ⅰ的LC-QQQ方法研究一般采用自下而上的策略[4-8]，即對水解后的IGF-Ⅰ特征片段進(jìn)行質(zhì)譜定量分析。該策略的前提是假設(shè)對蛋白酶水解產(chǎn)生的肽段的濃度計(jì)量能夠遷移并代表水解前的完整IGF-Ⅰ。這一策略解決了當(dāng)時(shí)由于質(zhì)譜檢測水平所限，而無法直接對大分子蛋白進(jìn)行質(zhì)譜檢測的困難，基于這一策略的IGF-Ⅰ質(zhì)譜檢測方法于2015年被WADA 正式認(rèn)可。但是此方法水解過程耗時(shí)，一般在十幾個小時(shí)，同時(shí)水解過程產(chǎn)生大量片段，對于水解效率的監(jiān)控和信號肽段的選擇以及肽段的純化等都影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨著樣品制備和質(zhì)譜檢測水平的發(fā)展，通過增加大分子蛋白質(zhì)帶電荷數(shù)來減小其質(zhì)荷比的方式，使對全鏈蛋白進(jìn)行直接檢測成為可能。近年來興奮劑檢測領(lǐng)域開始更多地關(guān)注自上而下的策略并開發(fā)相應(yīng)的檢測方法[9-10]。自上而下的策略，即對全鏈IGF-Ⅰ進(jìn)行質(zhì)譜定量分析，直接對目標(biāo)蛋白進(jìn)行提取、純化和分析，步驟更簡化，使其結(jié)果可能產(chǎn)生更小的偏差。與自下而上的策略相比，自上而下的策略在檢測方法簡便性和結(jié)果準(zhǔn)確性等方面更具優(yōu)勢。本研究采用自上而下的策略，使用LC-QQQ 技術(shù)建立檢測運(yùn)動員血清全鏈IGF-Ⅰ的檢測方法，并根據(jù)WADA GH Biomarkers指導(dǎo)文件要求，充分利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器設(shè)備，完成了LC-QQQ 檢測血清IGF-Ⅰ方法的建立及驗(yàn)證工作。定量限（limit of quantification，LOQ）、重復(fù)性（repeatability，Sr）、中間精密度（intermediate preci?sion，Sw）、線性范圍、攜帶污染和穩(wěn)定性等指標(biāo)均達(dá)到興奮劑檢測要求，可用于常規(guī)興奮劑檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備

美國安捷倫公司LC1290 液相分析儀連接ABI 公司QTRAP? 5500 質(zhì)譜儀，ESI 接口；臺式高速制冷離心機(jī)為美國Sigma公司生產(chǎn)；渦旋混勻器為美國Vortex公司生產(chǎn)；恒溫自動氮?dú)獯蹈蓛x（Techne）為國產(chǎn)設(shè)備。

1.2 試劑與耗材

色譜柱采用美國Waters 公司生產(chǎn)ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 Column，300?，1.7 μm，2.1 mm × 100 mm；色譜保護(hù)預(yù)柱為美國Waters 公司生產(chǎn)ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 VanGuard Pre-column，300?，1.7 μm，2.1 mm × 5 mm；在線過濾器、低吸附進(jìn)樣瓶套管為美國安捷倫公司生產(chǎn)。

大鼠血清購自南京生航生物技術(shù)有限公司；色譜純級甲酸、乙酸、甲醇、乙腈等化學(xué)試劑購自DIKMA公司；BSA 購自Sigma 公司。血清IGF-Ⅰ外部質(zhì)控樣品由WADA提供。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)IGF-Ⅰ（02/254）為重組的人源IGF-Ⅰ，購自NIBSC實(shí)驗(yàn)室；15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記的IGF-Ⅰ（15NIGF-Ⅰ）和胰島素樣生長因子2（insulin-like growth factor 2，IGF-Ⅱ）為重組的人源標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購自ProSpec公司。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息

1.3 試劑制備

10 mM 乙酸水溶液：乙酸6 μL 加純水10 mL（室溫保存1個月）。

10 ng/μL IGF-Ⅰ溶液：IGF-Ⅰ（02/254）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)8.5 μg加10 mM乙酸850 μL（分裝后－80℃保存）。

100 ng/μL15N-IGF-Ⅰ母液：15N-IGF-Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)25 μg加純水250 μL（分裝后－80℃保存）。

5 ng/μL15N-IGF-Ⅰ工作液：100 ng/μL15N-IGF-Ⅰ母液5 μL加純水95 μL（分裝后－80℃保存）。

40 ng/μL IGF-Ⅱ工作液：IGF-Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)50 μg加純水1250 μL（分裝后－80℃保存）。

1%乙酸水溶液：乙酸200 μL加純水19.8 mL。

2%甲酸水溶液：甲酸200 μL加純水9.8 mL。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品前處理

在大鼠血清基質(zhì)中添加10 ng/μL IGF-Ⅰ溶液配制濃度為50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL、1200 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液和濃度為50 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL 的質(zhì)控樣品。在1.5 mL 離心管中加入100 μL 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液、質(zhì)控樣品、待測樣品，加入5 ng/μL15N-IGF-Ⅰ和40 ng/μL IGF-Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使其終濃度分別為200 ng/mL 和2000 ng/mL。加入200 μL 濃度為1%的乙酸溶液，渦旋振蕩30秒鐘，充分混勻。加入400 μL乙腈，振蕩器室溫下振蕩，轉(zhuǎn)速900 rpm，振蕩15 分鐘，使用高速離心機(jī)，14000 g，離心10 分鐘。將上清液取出600 μL轉(zhuǎn)移至1.5 mL低吸附離心管中，40℃下氮?dú)獯蹈?。加?0 μL2%甲酸溶液復(fù)溶，振蕩器室溫下振蕩，轉(zhuǎn)速900 rpm，振蕩1 分鐘，充分混勻。使用低吸附移液器吸頭將離心管中的溶液全部轉(zhuǎn)移至低吸附進(jìn)樣瓶套管中，擰緊瓶蓋。將進(jìn)樣瓶排放在液相質(zhì)譜聯(lián)用儀自動進(jìn)樣盤上，在工作站編輯樣品信息后進(jìn)行樣品檢測。

1.4.2 色譜條件

使用ACQUITY UPLC Peptide BEH C18（300?，1.7 μm，2.1 mm ×100 mm）色譜柱，前端接ACQUI?TY UPLC Peptide BEH C18 VanGuard Pre-column（300?，1.7 μm，2.1 mm × 5 mm，1K - 30K）色譜保護(hù)預(yù)柱，并安裝安捷倫在線過濾器，柱溫45℃，流動相A 為0.1% 甲酸水溶液，流動相B 為0.1% 甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序共9分鐘，初始比例為流動相A∶B體積比為90∶10，到5 分鐘時(shí)為55∶45，6 分鐘時(shí)為0∶100，保持到8 分鐘，之后立即恢復(fù)為90∶10，直到9分鐘結(jié)束程序。進(jìn)樣體積5 μL，流速0.3 mL/min。

1.4.3 質(zhì)譜條件

掃描方式采用多反應(yīng)監(jiān)控模式（multiple reaction monitoring，MRM），離子模式為電噴霧正離子源ESI＋，離子噴霧電壓為5500 V，離子源溫度550℃。IGF-Ⅰ和15N 標(biāo)記的IGF-Ⅰ（15N-IGF-Ⅰ）定量離子對的質(zhì)譜條件見表2。

表2 質(zhì)譜條件

1.4.4 方法驗(yàn)證

應(yīng)用1.4.1、1.4.2、1.4.3 的方法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品，依據(jù)WADA 對檢測方法驗(yàn)證的相關(guān)要求對該方法的Sr、Sw、LOQ、線性范圍、攜帶污染和穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。對同一操作人員同一天內(nèi)配制的質(zhì)控樣品進(jìn)行6次檢測，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為Sr。對一周內(nèi)兩個不同操作者分別配制的質(zhì)控樣品各進(jìn)行6 次檢測，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為Sw。以能夠滿足Sr 和Sw 要求的最低濃度作為LOQ。以大鼠血清提取液作為空白，在1200 ng/mL濃度樣品后進(jìn)行空白樣品的檢測，重復(fù)12 次，以空白樣品與1200 ng/mL 濃度樣品中目標(biāo)離子對在相同保留時(shí)間處峰面積百分比作為攜帶污染率。將一年內(nèi)質(zhì)控樣品數(shù)據(jù)繪制成質(zhì)控圖，以平均值± 3 倍標(biāo)準(zhǔn)差作為可控范圍來監(jiān)控方法的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

根據(jù)IGF-Ⅰ的結(jié)構(gòu)特征，選擇正離子模式，對IGF-Ⅰ和15N-IGF-Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描。用MRM 模式優(yōu)化去簇電壓（declustering potential，DP）、碰撞能量（collision energy，CE）、碰撞室射出電壓（collision cell exit potential，CXP）等參數(shù)，對IGF-Ⅰ和15N-IGF-Ⅰ離子對進(jìn)行優(yōu)化。其中IGF-Ⅰ帶7個正電荷的分子離子峰的質(zhì)荷比為1093，帶8 個正電荷的分子離子峰質(zhì)荷比為957，在碰撞池碎裂產(chǎn)生的碎片離子質(zhì)荷比為473，故選擇1093→473 和957→473 作為IGF-Ⅰ的定性離子對。在15N-IGF-Ⅰ中只發(fā)現(xiàn)帶7個正電荷的分子離子峰，質(zhì)荷比為1107，經(jīng)碰撞碎裂為質(zhì)荷 比 為479 和1211的子離子，選擇1107→479 和1107→1211作為15N-IGF-Ⅰ的定性離子對。經(jīng)過對定性離子對的比較，本實(shí)驗(yàn)選擇分子離子峰質(zhì)荷比為1093→473 和1107→479 的離子對分別作為IGF-Ⅰ和15N-IGF-Ⅰ的定量離子對（見圖1）。

圖1 IGF-Ⅰ和15N-IGF-Ⅰ定量離子對MRM圖

2.2 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)比較了幾種不同品牌和規(guī)格型號的適用于多肽分析的反向C18色譜柱，與2.6 μm×50 mm色譜柱相比，使用2.1 μm×100 mm 的色譜柱進(jìn)行分離，由于粒徑減小、色譜柱長度長，基質(zhì)干擾減少，IGF-Ⅰ和內(nèi)標(biāo)的離子對的色譜峰峰形均得到明顯改善。為防止目標(biāo)物質(zhì)因管路非特異性結(jié)合而損失，在更換新的液相色譜柱時(shí)，用乙腈進(jìn)行活化后，使用含有0.5%大鼠血清的純水，20 μL進(jìn)樣20針，對液相色譜柱和整個管路系統(tǒng)進(jìn)行飽和處理。在乙腈/水作為流動相的體系中添加乙酸，可以調(diào)節(jié)系統(tǒng)pH 值，控制目標(biāo)物質(zhì)的保留時(shí)間。為了更適合常規(guī)批量檢測，在保證得到穩(wěn)定峰形的前提下進(jìn)行優(yōu)化，最終將樣品檢測時(shí)間從15分鐘縮短至9分鐘，節(jié)省了檢測時(shí)間。

2.3 提取條件的選擇

IGF-Ⅰ為人體自身分泌的激素，主要通過肝臟釋放進(jìn)入循環(huán)血液輸送至人體靶組織，因此能夠在人血清中檢測到IGF-Ⅰ。由于血清中絕大部分IGF-Ⅰ與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（insulin-like growth fac?tor-binding protein，IGFBP）和酸不穩(wěn)定性亞單位（ac?id-labile subunit，ALS）結(jié)合形成復(fù)合物，需在酸性條件下使IGF-Ⅰ游離出來，因此本實(shí)驗(yàn)采用加入1% 乙酸的方式游離IGF-Ⅰ。同時(shí)IGF-Ⅱ能夠與IGF-Ⅰ競爭結(jié)合IGFBP，因此加入過量IGF-Ⅱ，能夠防止游離的IGF-Ⅰ再次被IGFBP 結(jié)合[11]。本研究比較了人血清、羊血清和大鼠血清基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在相同保留時(shí)間位置，大鼠血清中未檢測到IGF-Ⅰ的定性離子對信號，說明大鼠血清中不含人IGF-Ⅰ，因此選擇大鼠血清作為配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的基質(zhì)。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 重復(fù)性（Sr）

由同一操作人員使用大鼠血清添加10 ng/μL IGF-Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制濃度為50 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL的質(zhì)控樣品，經(jīng)前處理采用同一條定量工作曲線，在相同儀器上對樣品進(jìn)行多次檢測，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，對低、中、高三個濃度的樣品分別進(jìn)行6次重復(fù)檢測得到的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Sr均小于10%，分別為5.0%、2.9%和3.6%，符合WADA技術(shù)文件的要求。

2.4.2 中間精密度（Sw）

一周內(nèi)由兩個不同操作者分別使用10 ng/μL IGF-Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到大鼠血清中，配制成50 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL的IGF-Ⅰ工作液各6份，并對每次配制的樣品進(jìn)行檢測。計(jì)算低、中、高三個濃度樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%，分別為14.00%、6.10%和6.11%，符合WADA技術(shù)文件要求。

2.4.3 定量限（LOQ）

WADA實(shí)驗(yàn)室國際標(biāo)準(zhǔn)對定量限的定義是能夠滿足Sr 和Sw 要求的最低濃度。本實(shí)驗(yàn)定量限濃度為50 ng/mL，Sr和Sw的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.0%和14.0%。

2.4.4 線性范圍

在100 μL大鼠血清中加入10 ng/μL IGF-Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制濃度為1200 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用逐級稀釋的方式，得到系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度分別為50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL、1200 ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)工作液與樣品一同經(jīng)過前處理過程并上機(jī)檢測，采用1093→473 的IGF-Ⅰ定量離子對和1107→479 的15N-IGF-Ⅰ定量離子對采集數(shù)據(jù)，用ABI MultiQuant 3.0.2 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以15NIGF-Ⅰ為內(nèi)標(biāo)，以1/x 為權(quán)重做線性回歸生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，r＞0.99。見圖2。

圖2 IGF-Ⅰ定量曲線

2.4.5 攜帶污染

為了避免在實(shí)際檢測工作中由于前一個樣品在系統(tǒng)中的殘留而導(dǎo)致影響下一個樣品定量結(jié)果的準(zhǔn)確，需要對攜帶污染進(jìn)行驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)中，以大鼠血清提取液作為空白，在1200 ng/mL 濃度樣品后進(jìn)行空白樣品的檢測，重復(fù)檢測12 次，觀察目標(biāo)離子對在相同保留時(shí)間處是否有信號響應(yīng)。12 次檢測結(jié)果顯示，空白樣品中相應(yīng)保留時(shí)間處無明顯信號響應(yīng)，未見攜帶污染。

方法驗(yàn)證指標(biāo)的結(jié)果匯總于表3。

表3 LC-QQQ檢測血清IGF-Ⅰ方法驗(yàn)證匯總

2.4.6 穩(wěn)定性

本研究分別使用兩支IGF-Ⅰ（02/254）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制兩套10 ng/μL IGF-Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中一套標(biāo)準(zhǔn)溶液用來配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，另一套標(biāo)準(zhǔn)溶液用來配制質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品作為內(nèi)部質(zhì)控監(jiān)控每批次檢測樣品，使用WADA 提供的血清IGF-Ⅰ樣品作為外部質(zhì)控監(jiān)控每天檢測樣品，以平均值±3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為可控范圍繪制質(zhì)控圖，如圖3。一年內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)值均在平均值±3 倍標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)，說明檢測方法長期穩(wěn)定性好。

圖3 低中高三水平濃度質(zhì)控樣品圖

3 結(jié)論

采用LC-QQQ技術(shù)建立了檢測人血清中全鏈IGF-Ⅰ的檢測方法。經(jīng)方法驗(yàn)證，該方法檢測選擇性好，穩(wěn)定性良好，能夠滿足WADA 指導(dǎo)文件要求。該方法已對實(shí)際運(yùn)動員血清樣品進(jìn)行檢測，經(jīng)與IGF-Ⅰ常規(guī)免疫檢測方法比對，高度相關(guān)，可作為檢測運(yùn)動員血清IGF-Ⅰ的常規(guī)質(zhì)譜檢測方法。