買衛(wèi)紅 吳 寧 王 霞 張曉慧

宮頸癌是女性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病常與多種因素相關(guān)，不潔性生活、多次分娩、早婚是宮頸癌的常見危險因素[1]，而人乳頭瘤病毒感染是誘發(fā)宮頸癌的主要原因[2]。早期宮頸癌癥狀隱匿，常無特征臨床表現(xiàn)而易被忽視，多數(shù)患者初診即為晚期。大多數(shù)晚期宮頸癌患者由于全身擴(kuò)散等原因失去手術(shù)機(jī)會，且治療后復(fù)發(fā)率高，因此晚期宮頸癌患者5年生存率不足30%[3]。近年來關(guān)于腫瘤靶向治療的相關(guān)研究趨于熱門，貝伐珠單抗是一種血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制劑，通過抑制腫瘤血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用[4]，但其治療效果受多種因素影響，且缺乏相關(guān)評估指標(biāo)，因此亟需相關(guān)標(biāo)志物對貝伐珠單抗治療效果進(jìn)行預(yù)測評估。miRNA與多種腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]，miR-21、miR-130已被證實能夠促進(jìn)腫瘤增殖轉(zhuǎn)移，其高表達(dá)多與患者預(yù)后不良相關(guān)[6-7]。但miR-21、miR-130水平與貝伐珠單抗治療效果的關(guān)系尚不完全明確。本研究采用RT-PCR技術(shù)檢測貝伐珠單抗治療后宮頸癌患者外周血中miR-21、miR-130表達(dá)水平，旨在為患者療效及預(yù)后評估提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年9月至2019年9月本院收治的化療耐藥的老年晚期宮頸癌患者63例為研究組，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照NCCN腫瘤學(xué)臨床實踐指南-宮頸癌(2019年第3版)[8]?；颊吣挲g65～79歲，平均年齡(74±8.14)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)陰道鏡檢查、經(jīng)病理科確診為Ⅲb～Ⅳ期宮頸癌；②患者均為多線含鉑藥物化療后耐藥或腫瘤進(jìn)展；③患者無重要臟器功能損傷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤患者；②合并肝臟、心臟、肺等臟器功能嚴(yán)重異?；颊?；③對貝伐珠單抗治療過敏患者。納入對象及家屬均簽署研究知情同意書，本研究并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 治療方法及評估

患者靜脈注射安維汀，單次用量為7.5 mg/kg，每3周注射1次，治療3～6個周期，平均4個周期。治療結(jié)束后采用RECIST標(biāo)準(zhǔn)[9]評估患者治療效果，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)及疾病進(jìn)展(PD)。

1.3 RT-PCR技術(shù)檢測患者外周血miR-21、miR-130表達(dá)水平

于患者空腹時無菌采集外周靜脈血3 ml，加入1 ml Trizol后保存于-80 ℃。提取外周血中總RNA，樣本使用NanoDrop 2000進(jìn)行檢測，OD260/OD280>1.8證明所提取RNA合格。使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司)將所提取到的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用RT-PCR技術(shù)檢測外周血中miR-21、miR-130表達(dá)。采用美國索萊寶公司通用RT-PCR試劑盒(M-MLV)，包含10×PCR Buffer 5 μl，dNTPs 1 μl，上、下游引物各1 μl，模板cDNA 2 μl，Taq Polymerase 0.5 μl，加入ddH2O至50 μl反應(yīng)體系。94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，共35個循環(huán)。采用2-??Ct法測定miR-21、miR-130相對表達(dá)量。??Ct=(CTmiRNA-CTU6RNA)實驗組-(CTmiRNA-CTU6RNA)對照組。所有引物均使用Primer 6.0設(shè)計，委托上海生工生物公司合成。miR-21：F：5’-ACGTTGTGCAGCTTATCAGACTG-3’，R：5’-AATGGTTGTTCTCCACACTCTC-3’；miR-130：F：5’-GGGGCAGTGCAATGTTAAAA-3’，R：5’-GTGCAGGGTCCGA-3’。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 治療前后外周血中miR-21、miR-130水平變化

檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)63例患者經(jīng)貝伐珠單抗治療后外周血miR-21、miR-130水平較治療前明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表1。

表1 治療前后患者外周血中miR-21、miR-130水平比較

2.2 外周血中miR-21、miR-130水平與治療效果的關(guān)系

63例患者經(jīng)貝伐珠單抗治療后根據(jù)療效分為：CR組8例、PR組17例、SD組22例、PD組16例。不同治療效果患者外周血中miR-21、miR-130水平具有明顯差異(P<0.001)，且CR組、PR組外周血中miR-21、miR-130水平明顯低于PD組(P<0.05)，見表2。

表2 不同療效患者外周血中miR-21、miR-130水平比較

2.3 外周血中miR-21、miR-130水平與患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析顯示治療后外周血miR-21高表達(dá)老年晚期宮頸癌患者經(jīng)貝伐珠單抗治療后36個月生存率明顯低于低表達(dá)患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A；外周血miR-130高表達(dá)患者生存率同樣低于低表達(dá)患者(P<0.05)，見圖1B。

圖1 外周血miR-21、miR-130水平與患者生存率的關(guān)系

3 討論

有研究表明我國宮頸癌發(fā)病率呈上升趨勢，且發(fā)病年齡趨于年輕化，而宮頸癌早期發(fā)病隱匿難以診斷，晚期患者常伴隨腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，導(dǎo)致宮頸癌成為我國致死率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[10]。目前針對宮頸癌的治療方法以手術(shù)為主，但晚期宮頸癌治療手段極為有限，導(dǎo)致患者生存率較低[11]。近年來靶向藥物治療惡性腫瘤的研究趨于熱門，重組抗HER2單克隆抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)逐漸成為治療乳腺癌的一線藥物[12]；程序性死亡分子抑制劑納武利尤單抗(Nivolumab)已被證實能夠有效延長晚期胃癌患者無病生存期[13]；而貝伐珠單抗(Bevacizumab)是一種VEGF抑制劑，通過抑制腫瘤血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用，研究表明貝伐珠單抗在治療晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)及各種婦科腫瘤時效果較好[14-15]，但目前臨床缺乏相關(guān)療效預(yù)測標(biāo)志物，無法對患者療效及預(yù)后進(jìn)行預(yù)測，不利于實現(xiàn)腫瘤的精準(zhǔn)治療。

本研究發(fā)現(xiàn)患者外周血中miR-21、miR-130水平與貝伐珠單抗治療老年晚期宮頸癌患者療效及預(yù)后相關(guān)。經(jīng)貝伐珠單抗治療后患者外周血中miR-21、miR-130水平明顯下降，且不同治療效果組的患者外周血miR-21、miR-130水平各不相同，獲得CR及PR的患者外周血miR-21、miR-130水平明顯低于SD組患者。miRNA是一種短鏈非編碼RNA，參與基因表達(dá)水平轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[16]，miRNA的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，而在腫瘤相關(guān)疾病中尤為顯著[17]。miR-21是一種促瘤miRNA，相關(guān)研究表明其通過抑制PTEN基因的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究顯示miR-21調(diào)節(jié)激酶磷酸化水平和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的生長[18]，下調(diào)miR-21的表達(dá)能夠顯著抑制結(jié)腸癌、肝癌、白血病等多種惡性腫瘤的進(jìn)展[19]。肝癌及卵巢癌患者外周血miR-130水平與腫瘤發(fā)病及耐藥相關(guān)，對miR-130的深入研究發(fā)現(xiàn)其特異性靶基因也為PTEN，轉(zhuǎn)染miR-130的乳腺癌細(xì)胞株P(guān)TEN mRNA的水平明顯下降[20]，提示miR-130通過下調(diào)PTEN表達(dá)促進(jìn)腫瘤發(fā)展，但其機(jī)制尚不完全明確。結(jié)合本研究結(jié)果，miR-21、miR-130常在腫瘤患者外周血中高表達(dá)，而貝伐珠單抗治療后其表達(dá)水平下降且與療效相關(guān)，提示外周血miR-21、miR-130水平可能作為預(yù)測貝伐珠單抗治療效果的評價指標(biāo)發(fā)揮作用。

miR-21、miR-130水平還能夠一定程度反映患者預(yù)后，研究表明miR-130可通過下調(diào)RUNX3表達(dá)水平導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后不良的發(fā)生[21]，而miR-21的高表達(dá)與乳腺癌、結(jié)腸癌、食管癌[22-23]等多種惡性腫瘤患者的預(yù)后不良相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)外周血miR-21、miR-130高表達(dá)的患者經(jīng)貝伐珠單抗治療后生存率明顯低于低表達(dá)患者，提示外周血miR-21、miR-130水平能夠作為貝伐珠單抗治療后患者預(yù)后的相關(guān)評估指標(biāo)。國內(nèi)學(xué)者Chen等[24]的研究發(fā)現(xiàn)miR-21能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞中拓?fù)洚悩?gòu)酶活性參與腫瘤耐藥的發(fā)生，可能與其導(dǎo)致的預(yù)后不良相關(guān)，而miR-130導(dǎo)致老年晚期宮頸癌患者預(yù)后不良的原因仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，老年晚期宮頸癌患者經(jīng)貝伐珠單抗治療后外周血miR-21、miR-130水平明顯下降，miR-21、miR-130水平與治療效果相關(guān)，且miR-21、miR-130高表達(dá)患者治療后死亡率較高。外周血miR-21、miR-130水平可能作為貝伐珠單抗治療老年晚期宮頸癌療效及預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)，為腫瘤精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。但本研究檢測樣本有限，且相關(guān)機(jī)制尚不明確，這些需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步改進(jìn)和探討。