儲小燕 方 洋 黃歐平

宮頸癌是嚴重威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，增殖與轉(zhuǎn)移依舊是宮頸癌難以治愈的原因，細胞增殖與凋亡的動態(tài)平衡是維持機體穩(wěn)態(tài)的重要方式[1]，凋亡抑制使細胞能夠逃脫死亡并有利于惡性轉(zhuǎn)化[2]。存活蛋白(Survivin，又名BIRC5基因)是1種凋亡抑制蛋白(inhibitor of apptosis protein,IAP)，能夠阻斷細胞凋亡。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中最小的1個成員[3]。目前多項研究表明Survivin基因在正常細胞與癌細胞的表達情況具有顯著的差異性[4]。本研究通過分析臨床宮頸癌患者癌組織及癌旁組織Survivin基因表達水平，了解該基因在宮頸癌組織是否高表達；通過慢病毒載體基因敲減技術(shù)，探明Survivin基因敲減后，Hela細胞的增殖能力、侵襲能力及凋亡速率改變情況，從而分析Survivin基因?qū)ela細胞增殖的調(diào)控機制。通過分析Survivin基因?qū)m頸癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機制，為臨床早期發(fā)現(xiàn)、家族篩查及基因治療宮頸癌等提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 人組織標本的收集

本研究對象為2012至2016年期間在江西省腫瘤醫(yī)院婦科治療的宮頸患者的石蠟包埋標本共計30例(其中鱗癌23例，腺體6例，腺鱗癌1例)。臨床分期為Ⅰa～Ⅱa期的早期宮頸癌患者，年齡為28～63歲，中位年齡為(51±3.5)歲，KPS≥90分。宮頸癌患者中行單純性根治性手術(shù)19例，術(shù)后補充放化療6例，單純補充化療5例。臨床資料：23例鱗癌患者病理分級為G1～G2級16例，G3級7例。6例腺癌G1～G2級4例，G3級2例。按2018年FIGO臨床分期標準術(shù)后確診鱗癌中Ⅰa～Ⅱa期18例；Ⅲc1期4例，Ⅲc2期1例；腺癌中Ⅰa～Ⅱa期6例；腺鱗癌中Ⅰa～Ⅱa期1例。選取腫瘤及遠癌組織(離腫瘤邊界5 cm以外，沒有轉(zhuǎn)移的組織定義為遠癌組織)分別分為A組及B組。每個病人分別以A1/B1，A2/B2，A3/B3......以此類推。

1.2 主要藥品及試劑

Hela細胞購自中科院細胞庫，Trizol試劑盒購自中國上海普飛公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒與RT-qPCR引物均購自廣州銳博生物科技有限公司，引物序列號如下：GAPDH (F:TGACTTCAACAGCGACACCCA;R:CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA,121bp),BIRC5(F:ACCGCATCTCTACATTCAAG;R:CAAGTCTGGCTCGTTCTC,113bp)。DNA Marker購于TAKARA公司，Code No.D526A；MTT試劑盒購自Genview公司；Transwell試劑盒購于Corning公司，Cat.No.3422；GIEMSA染色液購于Sigma公司，Cat.No.32884；凋亡試劑盒購于eBioscience公司，Cat.No.88-8007。

1.3 方法

1.3.1 RT-qPCR檢測Survivin基因在癌組織及遠癌組織中的表達水平 將組織樣品用無菌器械剪碎并勻漿，使用Trizol法提取組織總RNA，分光光度計分析測定所抽提RNA的濃度及質(zhì)量。使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，使用兩步法進行RT-qPCR。每個樣本設(shè)3個復孔，以控制實驗誤差，設(shè)GAPDH為內(nèi)參。

1.3.2 慢病毒載體細胞轉(zhuǎn)染 構(gòu)建survivin基因(別名BIRC5基因)慢病毒載體：Easy-siRNA設(shè)計目的慢病毒載體(GV248),合成oligo信息,RNAi慢病毒感染Hela細胞，qPCR實驗驗證挑選其最佳敲減靶點慢病毒,慢病毒細胞感染實驗分組及每組病毒用量情況如表1。分析得出基因敲減效率最佳組別，將培養(yǎng)的HELA細胞進行慢病毒介導的BIRC5敲減載體體外轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h后觀察并拍照。

表1 慢病毒細胞感染實驗分組及病毒用量

1.3.3 MTT法檢測細胞增殖能力 將經(jīng)BIRC5基因敲減慢病毒載體轉(zhuǎn)染的HELA細胞鋪入96孔細胞板培養(yǎng)，分別于第0 h,24 h,48 h,72 h及96 h終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)前4 h加入MTT，4 h后加入DMSO，震蕩25 min后酶標儀490/570 nm檢測OD值進行統(tǒng)計分析。

1.3.4 Transwell實驗檢測細胞遷移能力 將Transwell小試至于24孔培養(yǎng)板中，在上室中加入100 μl無血清培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中1 h后，移去上室中培養(yǎng)基并加入100 μl提前制備好的細胞懸液，并在下室中加入600 μl30%FBS培養(yǎng)基，同時，使用該細胞懸液鋪一塊MTS 96 孔板，每孔約接種5000 個細胞，接種后即測定OD570，作為轉(zhuǎn)移參照。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，完全去除小室內(nèi)培養(yǎng)基，并用棉拭子輕輕移去小室內(nèi)非轉(zhuǎn)移細胞，滴入Giemsa染色液染色轉(zhuǎn)移細胞35 min 后，將小室浸泡沖洗數(shù)次，空氣晾干，顯微鏡拍照。于96 孔板空中加入200 μl10%醋酸，揭下底膜，置于醋酸溶解，完全溶解后，吸取100 μl于另一孔中，檢測OD 570值。

1.3.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡速率 將Hela細胞鋪于6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，至覆蓋率約為70%是藥物有道凋亡。胰酶消化，收集培養(yǎng)孔中所有細胞，充分洗滌后加入Annexin V-APC ，于室溫避光染色10～15 min并上流式細胞儀檢測。每組均設(shè)三個復孔。

1.4 統(tǒng)計分析

利用統(tǒng)計軟件graphpad prism 5.0對實驗數(shù)據(jù)進行總體方差分析及組間配對t檢驗，實驗均重復3次及以上。

1.5 實驗倫理

本研究通過了江西省腫瘤醫(yī)院倫理委員會審核，研究所用人體樣本均由患者無償提供，捐獻者對研究知情并簽署知情同意。

2 結(jié)果

2.1 Survivin基因在宮頸癌初診早期患者中高表達

分析臨床30例患者癌組織及遠癌組織Survivin基因mRNA水平(圖1)可知，共計73%患者癌組織Survivin基因mRNA水平明顯高于遠癌組織(P<0.05)，其中，15例患者癌組織Survivin基因mRNA水平顯著高于遠癌組織(P<0.01)。

圖1 Survivin基因在宮頸癌患者癌組織及癌旁組織中的表達

2.2 Survivin基因RNAi慢病毒感染Hela細胞效果

如圖2所示，Survivin基因在Hela細胞中明顯表達。如圖3所示，Hela細胞中，相對于NC組，KD1組BIRC5基因敲減效率達到97.3% 。因此可以設(shè)定KD1組為其最佳敲減靶點慢病毒。

圖3 BIRC5慢病毒載體轉(zhuǎn)染HELA細胞的表達情況

2.3 BIRC5慢病毒載體轉(zhuǎn)染對HALE細胞增殖及凋亡的影響

HALE細胞經(jīng)BIRC5慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，檢測96h細胞吸光度，測定細胞增殖速率及細胞凋亡率，結(jié)果顯示，敲減組(KD)增殖曲線較空細胞對照組(CON)及陰性對照組(NC)平緩，且每個對應時間點其吸光度都低于其他對照組(圖4A)，表明BIRC5基因敲減后，Hale細胞增殖速率持續(xù)明顯降低。細胞凋亡統(tǒng)計圖(圖4B)結(jié)果顯示，BIRC5基因敲減后，Hale細胞凋亡率顯著增高。

2.4 BIRC5慢病毒載體轉(zhuǎn)染對HALE細胞遷移能力的影響

Transwell遷移實驗結(jié)果(圖5)顯示，BIRC5基因敲減后(KD組)，HALE細胞遷移數(shù)量明顯較少，細胞遷移率明顯低于對照組。

圖5 BIRC5慢病毒載體轉(zhuǎn)染HALE細胞遷移能力

3 討論

宮頸癌是世界第3大婦科惡性腫瘤，近年來發(fā)病呈年輕化趨勢。難治性宮頸癌的宮旁浸潤和遠處轉(zhuǎn)移嚴重影響宮頸癌的治療效果和預后。影響轉(zhuǎn)移性和復發(fā)性宮頸癌的臨床預后主要因素尚未完全揭示。了解癌癥進展相關(guān)的分子機制對于尋找更好的難治性宮頸癌的治療至關(guān)重要。survivin已被發(fā)現(xiàn)在腫瘤進展中起著至關(guān)重要的作用，研究表明，survivin基因在非小細胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、甲狀腺癌等中高表達，且survivin陽性表達患者中位生存時間明顯低于survivin陰性表達者,并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

GAPDH為內(nèi)參基因

A為MTT檢測細胞增殖；B為流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果統(tǒng)計圖。CON組為空細胞組，NC組為陰性對照組，KD組為敲減組。

并有報道survivin基因在結(jié)腸息肉、乳腺炎，角化皮炎及子宮肌瘤中等一些癌前損傷及良性腫瘤組織中高表達，說明survivin基因的表達出現(xiàn)在惡性轉(zhuǎn)化前期，并可能具有促進這些損傷惡性轉(zhuǎn)化的作用[5-6]。雖然Survivin抑制細胞凋亡的機制尚不清楚，但Survivin與引發(fā)劑或效應caspase的直接和間接結(jié)合被認為有助于Survivin抑制細胞凋亡[7]。Caspase-3這種酶能溶解多種蛋白質(zhì)，誘導細胞死亡,對細胞凋亡有著至關(guān)重要的作用[8]，推測Survivin與效應caspase-3的直接結(jié)合，但與其他IAP不同，Survivin不具有負責caspase-3與Bir結(jié)構(gòu)域?qū)拥慕Y(jié)構(gòu)部分[9]，一些研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎X相互作用蛋白(Hbxip)與procaspase-9前體結(jié)合是由Survivin介導的抑制caspase-9的機制[10]，并推測X-連接的IAP(XIAP)也含有BIR結(jié)構(gòu)域，導致Survivin介導caspase-9的抑制[11]。多項研究亦表明caspase-9作為細胞凋亡的啟動子，對于惡性腫瘤也有著重要的作用[12]。然而，survivin基因在宮頸中的作用癌癥還沒有被研究。我們先前的研究首次發(fā)現(xiàn)survivin是宮頸癌發(fā)展的關(guān)鍵因素， 本研究表明，與對照組織相比，survivin在宮頸癌組織中明顯上調(diào)，本實驗發(fā)現(xiàn)survivin基因在宮頸癌組中高表達；且行survivin基因敲減后可明顯抑制hela細胞的增殖、遷移及侵襲能力，加速癌細胞的凋亡。提示survivin 基因可能在調(diào)節(jié)宮頸癌浸潤和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，對宮頸癌的臨床診斷和治療具有重要的意義。