彭艷艷 李 聰 張欣宇

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率均居首位的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病主要與嚴(yán)重環(huán)境污染、高齡、吸煙等因素密切相關(guān)[1]。非小細(xì)胞肺癌(non small cell Lung cancer,NSCLC)在肺癌患者中占80%左右[2]，該病早期無(wú)特異性表現(xiàn)，臨床上絕大多數(shù)患者確診時(shí)大多數(shù)已屬晚期，增加了臨床治療難度。微小核糖核酸是機(jī)體代謝分子群中新近發(fā)現(xiàn)的生物活性RNA分子，具有高度保守性、組織特異性等特點(diǎn)，可在不同疾病人群的血清和組織中呈特異性和穩(wěn)定表達(dá)，與癌癥患者的診斷、病理分型、預(yù)后等具有重要聯(lián)系[3]。其中微小核糖核酸-92a(microRNA-92a,miR-92a)是1種重要的促癌基因，其在肺癌組織中的高表達(dá)與化療敏感性及不良預(yù)后有關(guān)[4]；微小核糖核酸-196b(microRNA-196b,miR-196b)是已被研究證實(shí)與結(jié)直腸癌、宮頸癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移聯(lián)系緊密的1種促癌基因，可能與NSCLC患者的不良預(yù)后有關(guān)[5]。目前對(duì)于miR-92a和miR-196b在NSCLC中表達(dá)及預(yù)后的相關(guān)文獻(xiàn)鮮少有見(jiàn)報(bào)道，基于此，本研究分析了NSCLC患者癌組織中miR-92a和miR-196b的表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床NSCLC預(yù)后的評(píng)估與改善提供一些理論參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性選取2015年6月至2017年12月期間于我院經(jīng)手術(shù)治療的120例NSCLC患者作為研究對(duì)象，對(duì)其臨床資料和癌組織標(biāo)本進(jìn)行回顧性分析。120例患者中男性84例，女性36例，年齡35～82歲，平均年齡(60.72±12.46)歲；病理證實(shí)腺癌68例，鱗癌48例，其他癌4例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)合影像學(xué)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等，所有患者均符合NSCLC的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，并經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為NSCLC者；②均行手術(shù)切除治療，并保存癌組織標(biāo)本者；③術(shù)前未接受放、化療或分子靶向治療者；④均完成2年隨訪，且具備完整的臨床及隨訪資料者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重肝腎功能障礙、代謝性疾病者；②合并其他惡性腫瘤、嚴(yán)重心腦血管疾病者；③精神異常、認(rèn)知障礙患者。選取NSCLC組織本研究在獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)后實(shí)施，研究?jī)?nèi)容設(shè)計(jì)符合《世界赫爾辛基宣言》。所有患者癌組織標(biāo)本均在標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)切除后半小時(shí)內(nèi)經(jīng)無(wú)菌、無(wú)核酸酶水沖洗，并放入液氮中，冷凍保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 隨訪方案 隨訪從患者切除手術(shù)后首日開(kāi)始，采用門(mén)診隨訪以及電話隨訪的方式對(duì)入組患者進(jìn)行追蹤，詳細(xì)記錄患者腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移情況，隨訪至術(shù)后2年。

1.2.2 分組方法 以患者隨訪兩年內(nèi)出現(xiàn)的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移情況表示為預(yù)后不良，腫瘤復(fù)發(fā)指影像學(xué)顯示肺部出現(xiàn)新發(fā)病灶；轉(zhuǎn)移指臨床及影像學(xué)檢查顯示有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移病灶均經(jīng)病理檢查進(jìn)行診斷確診[7]。將所有入組患者按照隨訪期間有無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移分為兩組：有局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)后不良組和無(wú)局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)后良好組。

1.2.3 miR-92a、miR-196b的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 取兩組患者凍存的組織標(biāo)本，于液氮中研磨至粉末狀，參照Trizol試劑(Invitrogen公司)總RNA提取試劑盒的規(guī)定步驟提取總RNA，即刻逆轉(zhuǎn)錄成cDNA用于擴(kuò)增。選RUN6為內(nèi)參照(Ribo Bio公司)，采用美國(guó)ABI公司7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，其中miR-196b引物序列為：上游5'-TAGGTACCACTTTATCCCGTTCACCA-3'；下游5'-ATCTC GAGGCAGGGAGAGAGGAATAA-3'；miR-92a引物序列為：上 游 5'-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA-3'，下游5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'；U6引物序列為：上游5'-CTC GCTTCGGCAGCACA-3' ；下游 5' -AACGCTTCA GAATTTGCGT-3'。

經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后，獲得CT值。以2-△CT表 miR-92a和miR-196b的相對(duì)表達(dá)量，其中△Ct = miR-92a(或miR-196b)平均Ct值-U6平均Ct值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，本研究中涉及的計(jì)數(shù)資料用%表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用“Mean±SD”表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic回歸模型；通過(guò)ROC曲線分析miR-92a、miR-196b對(duì)NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值；對(duì)符合正態(tài)分布的兩數(shù)據(jù)采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析，均以P<0.05提示為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者預(yù)后情況

在120例NSCLC患者中有62例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為51.67%，為預(yù)后不良組；58例未出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，為預(yù)后良好組。預(yù)后不良組中出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)35例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，肺內(nèi)轉(zhuǎn)移9例，腎上腺轉(zhuǎn)移6例。

2.2 兩組患者癌組織中miR-92a、miR-196b表達(dá)水平比較及相關(guān)性

經(jīng)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)后，預(yù)后不良組癌組織中miR-92a、miR-196b的相對(duì)表達(dá)量明顯高于預(yù)后良好組(P<0.05)，見(jiàn)表1。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-92a與miR-196b的表達(dá)存在明顯的正相關(guān)性(γ=0.479，P=0.005)。

表1 兩組癌組織中miR-92a、miR-196b表達(dá)水平比較

2.3 NSCLC患者預(yù)后不良的單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，兩組在年齡、性別、腫瘤直徑、病理組織學(xué)類(lèi)型及術(shù)后是否行放化療方面比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，兩組在腫瘤TNM分期、術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌組織miR-92a表達(dá)和癌組織miR-196b表達(dá)方面存在明顯差異(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組患者肺血管炎的單因素分析(例，%)

2.4 影響NSCLC患者預(yù)后不良的多因素Logisitic回歸分析

以NSCLC患者術(shù)后是否出現(xiàn)預(yù)后不良作為因變量，將單因素中差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素(腫瘤TNM分期、術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌組織miR-92a表達(dá)和癌組織miR-196b表達(dá))作為自變量，并進(jìn)行賦值，腫瘤TNM分期(Ⅰ期～Ⅱ期=0，Ⅲ期～Ⅳ期=1)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無(wú)=0，有=1)、癌組織miR-92a表達(dá)(<3.0=0，≥3.0=1)、癌組織miR-196b表達(dá)(<3.3=0，≥3.3=1)，并將其納入Logisitic回歸模型中，結(jié)果顯示TNM分期為III期～I(xiàn)V期、術(shù)前有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌組織miR-92a≥3.0和癌組織miR-196b≥3.3是NSCLC患者出現(xiàn)預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，見(jiàn)表3。

表3 影響NSCLC患者預(yù)后不良的多因素Logisitic回歸分析

2.5 單項(xiàng)指標(biāo)預(yù)測(cè)與聯(lián)合預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后不良的ROC曲線分析

ROC曲線分析結(jié)果顯示，癌組織中miR-92a、miR-196b表達(dá)量單獨(dú)預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后不良的ROC曲線下面積分別為0.718和0.736，均低于兩指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后不良的ROC曲線下面積0.804(P<0.05)；且癌組織中miR-92a、miR-196b表達(dá)量單獨(dú)預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后不良時(shí)的截?cái)嘀捣謩e為：3.092和3.855，見(jiàn)圖1，表4。

圖1 癌組織中miR-92a、miR-196b表達(dá)量單項(xiàng)預(yù)測(cè)與聯(lián)合預(yù)測(cè)ROC曲線

表4 癌組織中miR-92a、miR-196b表達(dá)預(yù)測(cè)患者預(yù)后的ROC曲線AUC值

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微小核糖核酸的發(fā)現(xiàn)為NSCLC的診斷與預(yù)后評(píng)估提供了新的思路，亦越來(lái)越受臨床關(guān)注。微小核糖核酸是具有調(diào)控基因表達(dá)功能的生物活性RNA分子，在不同疾病人群的血漿和組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)水平，因其的組織特異性和穩(wěn)定性?xún)?yōu)勢(shì)，常作為腫瘤疾病診斷和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物[8-9]。miR-92a、miR-196b均是與NSCLC癌細(xì)胞增殖、分化、凋亡關(guān)系密切的微小核糖核酸分子，參與NSCLC的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程。本研究研討miR-92a與miR-196b在NSCLC癌組織中的表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系，對(duì)于臨床上指導(dǎo)NSCLC患者術(shù)后的早期預(yù)防與控制具有重要作用。

本研究通過(guò)半定量RT-PCR法檢測(cè)得出預(yù)后不良組癌組織中miR-92a、miR-196b的相對(duì)表達(dá)量明顯高于預(yù)后良好組，可見(jiàn)miR-92a、miR-196b在NSCLC預(yù)后不良患者癌組織中呈較高表達(dá)，與國(guó)內(nèi)的研究結(jié)果較為一致[10-11]。本研究中，NSCLC預(yù)后不良的單因素及多因素分析結(jié)果顯示，TNM分期為III期～I(xiàn)V期、術(shù)前有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌組織miR-92a≥3.0和癌組織miR-196b≥3.3是NSCLC患者出現(xiàn)預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素?？梢?jiàn)，miR-92a、miR-196b在癌組織中的高表達(dá)與NSCLC術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要聯(lián)系。術(shù)前TNM分期為Ⅲ期～Ⅳ期以出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均提示NSCLC患者已處于癌癥的中晚期，病情嚴(yán)重程度較重，腫瘤的惡性程度較高，此類(lèi)患者經(jīng)手術(shù)治療后往往容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后較差。miR-92a是miR-17-92家族中的重要成員，在前列腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤組織呈異常表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。高表達(dá)miR-92a對(duì)NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的影響機(jī)制可能在于：①靶向與調(diào)控人體抑癌或促癌基因的表達(dá)，進(jìn)一步發(fā)揮促癌作用。國(guó)外學(xué)者Tsuch-ida等[12]在研究報(bào)告中指出，miR-92a能通過(guò)靶向調(diào)控Bcl-2家族因子的表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)結(jié)腸癌組織中癌細(xì)胞的凋亡；還有研究表明[13]，過(guò)表達(dá)的miR-92a可通過(guò)對(duì)抑癌基因p53家族成員deltanp63beta表達(dá)的調(diào)節(jié)，發(fā)揮促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖并抑制癌細(xì)胞凋亡的作用；②高表達(dá)miR-92a可能通過(guò)降低化療藥物的敏感性影響NSCLC患者預(yù)后。宋先璐等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a可降低肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性而增加其對(duì)化療藥物的敏感性，使患者手術(shù)治療后即使進(jìn)行放化療治療，亦出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后較差。miR-196b是位于人類(lèi)7號(hào)染色體上的微小核糖核酸因子，可通過(guò)與不同的靶基因結(jié)合發(fā)揮抑癌或促癌作用[15]。肺癌組織中高表達(dá)的miR-196b對(duì)患者不良預(yù)后的影響主要認(rèn)為與其對(duì)癌細(xì)胞遷移、侵襲促進(jìn)作用有關(guān)。Liao等[16]在研究高表達(dá)miR-196b對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，miR-196b主要通過(guò)結(jié)合具有抑制腫瘤作用的轉(zhuǎn)錄因子ETS2而發(fā)揮促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。因此，癌組織中miR-92a、miR-196b的較高表達(dá)均會(huì)增加NSCLC患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致預(yù)后不良，進(jìn)一步可說(shuō)明兩指標(biāo)之間互為正相關(guān)關(guān)系，這與本研究中miR-92a、miR-196b的相關(guān)性分析結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，癌組織中miR-92a、miR-196b表達(dá)量單獨(dú)預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后不良的ROC曲線下面積均低于兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)的ROC曲線下面積，表明癌組織中miR-92a、miR-196b的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值更高，可作為預(yù)測(cè)NSCCL患者不良預(yù)后的新指標(biāo)，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，miR-92a、miR-196b在NSCLC預(yù)后不良患者癌組織中呈高表達(dá)，并互為正相關(guān)性；二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于臨床上預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后具有較好的應(yīng)用價(jià)值，可作為預(yù)測(cè)NSCCL患者不良預(yù)后的分子標(biāo)志物。因而臨床上可通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)患者癌組織miR-92a、miR-196b水平以篩選手術(shù)后預(yù)后不良的高風(fēng)險(xiǎn)人群，并盡早采取控制措施，以改善患者預(yù)后。