胡 波 朱琰琰 徐 穎

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率均位居首位的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌的80%以上[1]。早期NSCLC發(fā)病隱匿且無明顯臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致多數(shù)患者初診即為晚期[2]，而絕大多數(shù)晚期患者由于多種原因無法耐受手術(shù)治療，常導(dǎo)致患者預(yù)后不良的發(fā)生[3]。吉非替尼是一種表皮生長因子酪氨酸受體抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)，已被證實其能有效延長NSCLC患者生存時間[4]，但大多數(shù)患者用藥過程中會發(fā)生獲得性耐藥，導(dǎo)致治療失敗，因此對耐藥機制進行深入研究尤為重要。miRNA是一種長度約為20 bp的游離非編碼RNA，研究表明其在多種腫瘤相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用[5]。相關(guān)研究報道m(xù)iR-21表達水平與NSCLC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為NSCLC診斷及預(yù)后相關(guān)指標應(yīng)用于臨床，而miR-155在肺癌中的高表達常與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)[6]，但二者在吉非替尼治療過程中發(fā)生耐藥的相關(guān)分子機制尚不明確。本研究采集吉非替尼獲得性耐藥NSCLC患者血清及組織并檢測相關(guān)miRNA表達水平，旨在為解決NSCLC患者吉非替尼獲得性耐藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2013年4月至2016年4月在本院接受吉非替尼治療出現(xiàn)耐藥的晚期NSCLC患者80例作為研究組，耐藥標準參照中華醫(yī)學(xué)會肺癌臨床診療指南(2018版)[7]。納入標準：①所有患者經(jīng)細胞學(xué)檢查確診為NSCLC，根據(jù)TNM分期均為Ⅲ～Ⅳ期；②患者僅接受過吉非替尼單藥治療，未接受過其他靶向治療及生物免疫治療；③無合并其他肺部疾病和腫瘤。未達上述標準的NSCLC患者不納入研究組。研究組中男性49例，女性31例，年齡為41～72歲，平均(57.14±9.33)歲。另選取60例吉非替尼治療效果良好、6個月以上病情無進展NSCLC患者為對照組，其中男性33例，女性27例，年齡為43～71歲，平均(58.25±9.14)歲。本研究中所有患者均簽署知情同意書并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 RT-PCR檢測技術(shù)檢測miRNA-21、miRNA-155水平

所有患者入組第1天無菌采集患者外周血10 ml，3 000 r/min離心10 mim分離血清，于-80 ℃冰箱中低溫儲存。采用Serum RNA Purification Mini Kit試劑盒(加拿大Norgen Biotek公司)提取血清中總RNA，于-80 ℃保存。收集患者支氣管鏡檢采集的腫瘤組織，采用Trizol試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司)提取總RNA，保存于-80 ℃。所提取RNA使用NanoDrop 2000檢測，其A260/A280>1.8提示樣品合格，使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板備用。

使用SuperScriptTMⅢ One-Step RT-PCR System with PlatinumTMTaq DNA Polymerase試劑盒(美國Thermo Fisher公司)檢測miRNA表達情況。體系中加入2×Reaction Mix 25 μl，正、反向引物各1 μl，cDNA 2 μl，SuperScriptTMⅢ PT/PlatinumTMTaq Mix 2 μl，加入ddH2O至50 μl，反應(yīng)條件為94 ℃ 預(yù)變性2 min，94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、68 ℃ 60 s，共40個循環(huán)，結(jié)果采用2-??Ct法進行分析。所有引物均委托上海生工生物公司合成，miRNA-21引物：F：5’-AGACATCATACAGAGTGTCG-3’，R：5’-GCATCTAGGATCGACGTG-3’；miR-NA-155引物：F：5’-GCCGCTTAATGCTAATCGT-3’，R：5’-CAGTGCTGGGTCCGACTGA-3’。

1.3 免疫組化檢測肺癌組織中EGFR表達情況

使用SP免疫組化試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司)檢測NSCLC患者腫瘤組織中EGFR的表達情況，按照染色深度進行評分：未著色0分、淡黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分。再按陽性細胞比例進行評分：≤25%為1分、>25%～50%為2分、>50%～75%為3分、>75%為4分。將上述評分相乘記做總評分，<3分為低表達，≥3分為高表達。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 2組患者臨床資料比較

比較結(jié)果顯示研究組及對照組患者年齡、性別、是否吸煙、腫瘤組織學(xué)類型、癌癥分期及腫瘤分化程度均無明顯差異(P>0.05)，見表1。

表1 2組患者臨床資料比較(例，%)

2.2 2組患者miRNA-21、miRNA-155表達水平差異

經(jīng)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)研究組血清、組織中miR-21水平及血清miR-155水平明顯高于對照組(P<0.001)，但組織中miR-155水平與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

表2 2組患者miRNA-21、miRNA-155表達水平比較

2.3 肺癌組織EGFR表達與miRNA-21、miRNA-155水平的關(guān)系

免疫組化結(jié)果顯示80例吉非替尼獲得性耐藥NSCLC患者組織中EGFR高表達59例，低表達21例。EGFR高表達患者血清、組織中miR-21及血清miR-155水平明顯高于EGFR低表達患者(P<0.05)，而組織中miR-155水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表3。

表3 miRNA-21、miRNA-155與肺癌組織中EGFR的關(guān)系

2.4 耐藥組miR-21、miR-155表達水平與患者生存率的關(guān)系

采用門診、電話、微信等方式對研究組患者進行隨訪，隨訪間隔3個月，隨訪患者死亡或截止2019年4月終止隨訪。所有死亡患者死因均為肺癌轉(zhuǎn)移或并發(fā)癥。隨訪結(jié)果繪制生存曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中miR-21、miR-155高表達患者生存率明顯低于低表達患者(χ2=14.179，P<0.001；χ2=18.338，P<0.001)，見圖1A；而組織中miR-21高表達患者生存率明顯低于低表達患者(χ2=12.195，P<0.001)，但miR-155高表達患者生存率較低表達患者相比無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=1.162，P>0.05)，見圖1B。

A：血清中miR-21、miR-155水平與患者預(yù)后的關(guān)系；B：組織中miR-21、miR-155水平與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼具有抑制腫瘤血管生成、抑制細胞分裂和促進細胞凋亡的作用[8]，目前研究已經(jīng)證實其能夠改善晚期NSCLC及轉(zhuǎn)移性NSCLC患者臨床癥狀并延長患者生存期，適用于化療不耐受和化療失敗的NSCLC患者[9]。但臨床試驗發(fā)現(xiàn)大多數(shù)吉非替尼治療有效的NSCLC患者在接收治療6個月后會發(fā)生不同程度的耐藥，導(dǎo)致治療失敗。相關(guān)研究表明EGFR基因二次突變、PI3K/AKT通路過度激活和腫瘤微環(huán)境的改變在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用[10-12]，但其具體機制尚需深入研究。

研究發(fā)現(xiàn)miR-21在多種腫瘤細胞中高表達，與腫瘤的增殖轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，被稱作促癌miRNA[13]，高表達的miR-21調(diào)控其下游多個抑癌基因而促進腫瘤的發(fā)展。國內(nèi)學(xué)者Dai的研究發(fā)現(xiàn)miR-21在NSCLC患者血清中表達水平明顯上升，且miR-21的高表達常與患者預(yù)后不良相關(guān)[14]，miR-21還能夠通過PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)NSCLC化療的敏感性[15]。故miR-21表達水平可作為患者預(yù)后相關(guān)指標發(fā)揮臨床作用。miR-155在肺癌、乳腺癌、胰腺癌等腫瘤中表達水平升高[16]，且miR-155的高表達常與腫瘤耐藥的發(fā)生相關(guān)。研究表明血清中miR-155高表達的乳腺癌患者曲妥珠單抗治療效果較差[17]；而利妥昔單抗治療彌漫性大B細胞淋巴瘤患者時發(fā)現(xiàn)組織中miR-155高表達者常伴隨預(yù)后不良的發(fā)生[18]。本研究發(fā)現(xiàn)研究組血清中miR-21、miR-155表達水平及組織中miR-21水平明顯高于對照組，提NSCLC患者吉非替尼耐藥的發(fā)生可能與miR-21、miR-155水平相關(guān)，但研究組組織中miR-155水平與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，可能與患者的特異性及免疫組化評分標準不同相關(guān)。

有研究表明EGFR通路能夠調(diào)控miR-21水平，尤其在不吸煙的NSCLC患者中EGFR突變上調(diào)其磷酸化水平，導(dǎo)致miR-21水平升高抑制細胞凋亡[19]。Li的研究發(fā)現(xiàn)miR-21的高表達可能通過PTEN基因調(diào)控EGFR-TKI耐藥的發(fā)生[20]。而miR-155可能通過NF-κB通路驅(qū)動FOXO 3a導(dǎo)致吉非替尼耐藥的發(fā)生[21]，但具體機制尚不完全明確。而本研究發(fā)現(xiàn)在EGFR高表達患者外周血miR-21、miR-155水平及組織中miR-21水平明顯高于低表達患者，提示EGFR高表達患者可能通過上調(diào)miR-21及miR-155水平介導(dǎo)吉非替尼耐藥的發(fā)生，而組織miR-155水平無明顯差異可能與患者異質(zhì)性相關(guān)。生存曲線說明血清miR-21、miR-155高表達及組織miR-21高表達患者常伴隨預(yù)后不良的發(fā)生。

綜上所述，吉非替尼獲得性耐藥NSCLC患者血清中miR-21、miR-155及組織中miR-21水平明顯上升，且與腫瘤組織中EGFR水平相關(guān)，生存曲線結(jié)果為血清中miR-21、miR-155和組織中miR-21高表達患者生存率明顯低于低表達患者，而組織中miR-155水平與上述指標無關(guān)。血清miR-21、miR-155和組織中miR-21水平可能作為相關(guān)指標對吉非替尼獲得性耐藥NSCLC患者預(yù)后進行評估，但其與吉非替尼獲得性耐藥發(fā)生的相關(guān)性仍需進一步研究。