張孟玲 程曄 金菊

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的癌癥，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占肺癌的80%～85%以上，而肺腺癌占NSCLC的40%～50%[1]。根據(jù)病理類型以及分子表型確定肺癌亞組，是目前肺癌臨床個體化治療的決定性因素[2]。70%的肺癌發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，僅能通過細針穿刺（fine-needle aspiration,FNA）或胸水等獲取小組織或少量細胞進行檢測，進而明確病理類型和分子表型。間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）為肺癌的驅(qū)動基因之一，若腫瘤細胞中存在ALK融合基因表達，稱之為ALK陽性NSCLC，其是NSCLC的一個分子亞型，常見于腺癌，該類患者通?？蓮腁LK-酪氨酸激酶抑制劑（ALK-TKI）治療中獲益[3-4]。有研究指出，對于晚期NSCLC、腺癌或含腺癌成分的其他類型肺癌，應(yīng)在診斷的同時常規(guī)進行ALK融合基因和表皮生長因子受體基因突變檢測[5]。然而，40%的進展期NSCLC常不具備活檢組織，僅可進行細胞學(xué)診斷。收集、濃縮細胞學(xué)樣本制成細胞蠟塊，能最大限度保留殘留的組織結(jié)構(gòu)。本研究旨在分析檢測NSCLC患者細胞學(xué)樣本ALK水平的臨床意義，以便為臨床腫瘤治療提供重要依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 回顧性分析2016年1月至2020年12月在中國科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行ALK檢測的NSCLC患者254例，其中男138例，女116例；年齡37～87（62.5±1.06）歲；細胞學(xué)樣本類型：胸水樣本 144例，F(xiàn)NA樣本110例（包括鎖骨上淋巴結(jié)70例、肺部腫塊21例、經(jīng)支氣管鏡活檢和超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的經(jīng)支氣管針吸活檢標(biāo)本19例）；上述細胞學(xué)樣本中同時具有小活檢組織樣本者43例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過。

1.2 方法 胸水樣本經(jīng)離心、沉降后制作液基細胞學(xué)涂片2張，F(xiàn)NA樣本經(jīng)常規(guī)制作細胞學(xué)涂片2張；后將每例剩余細胞學(xué)樣本經(jīng)離心制作成細胞蠟塊并制作石蠟切片（4 μm）；將小活檢組織樣本常規(guī)制作石蠟切片（4 μm）。細胞學(xué)涂片予巴氏染色，石蠟切片予常規(guī)HE染色，由高年資病理診斷醫(yī)師進行陽性評估并確定為NSCLC后，在自動染色機（瑞士Roche公司）上進行ALK（克隆號：D5F3）免疫組化染色，并采用熒光原位雜交試劑盒（人類ALK基因融合檢測探針，武漢康錄生物技術(shù)股份有限公司）在全自動玻片處理系統(tǒng)（型號：LBP-6612，廣州安必平醫(yī)藥科技公司）中進行熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization,FISH）檢測。

1.3 免疫組化結(jié)果判讀 腫瘤細胞中可見強的顆粒狀細胞質(zhì)染色信號即為ALK陽性表達。應(yīng)排除已知染色偽影，如肺泡巨噬細胞中較淡的胞質(zhì)染色、神經(jīng)起源細胞（神經(jīng)與神經(jīng)節(jié)細胞）染色、腺上皮染色及浸潤的淋巴細胞染色。正常NSCLC黏膜（包括黏蛋白）與壞死的腫瘤區(qū)域內(nèi)見到的一些背景染色也應(yīng)排除。

2 結(jié)果

254例樣本均順利完成ALK免疫組化染色，其中ALK陽性19例，陽性檢出率為7.48%。胸水樣本ALK陽性檢出率為2.78%（4/144），F(xiàn)NA樣本ALK陽性檢出率為13.64%（15/110）。43例同時有細胞學(xué)樣本和組織學(xué)樣本的患者中，有5例兩種樣本中免疫組化染色ALK均為陽性（圖1）。在細胞學(xué)樣本中，有2例免疫組化染色ALK陽性者同時行FISH檢測，結(jié)果顯示ALK基因重排陽性（圖2）。7例ALK免疫組化染色陽性患者已進行ALK-TKI治療，其中接受治療2個月以上者6例，隨訪1年后，達到部分緩解4例，完全緩解2例。

圖1 1例非小細胞肺癌（NSCLC）患者細胞蠟塊和活檢組織樣本間變性淋巴瘤激酶（ALK）檢測所見[a：細胞蠟塊HE染色，×10；b：活檢組織HE染色，×10；c：細胞蠟塊免疫組化染色，×10；d：活檢組織免疫組化染色，×10]

圖2 1例非小細胞肺癌（NSCLC）患者細胞蠟塊間變性淋巴瘤激酶（ALK）檢測所見[a：細胞蠟塊HE染色，×10；b：細胞蠟塊免疫組化染色，×10；c：細胞蠟塊熒光原位雜交（FISH），×100]

3 討論

組織病理學(xué)診斷是診斷腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，但晚期肺癌患者通常無法獲得手術(shù)標(biāo)本，而細胞學(xué)樣本則具有來源豐富，取樣簡單、快速、方便等特點。細胞學(xué)樣本經(jīng)離心后制作成細胞蠟塊石蠟切片，其具有組織學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)，與傳統(tǒng)巴氏涂片聯(lián)合使用，可提高檢測的靈敏度和特異度，且在行免疫組化和分子檢測時，效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)巴氏涂片[6]。在腫瘤細胞量足夠的情況下制作細胞蠟塊石蠟切片，可顯示ALK陽性肺腺癌的一些形態(tài)學(xué)特征，如篩孔狀結(jié)構(gòu)、明顯的核仁和細胞外黏液等，結(jié)合臨床特征，對于篩選潛在ALK陽性率較高的肺腺癌患者可有所幫助[7]。在實際工作中，制作細胞蠟塊前需進行樣本評估，通常漿膜腔積液、FNA及細胞量豐富的超聲引導(dǎo)下穿刺樣本為較優(yōu)檢測標(biāo)本。漿膜腔積液樣本送檢量建議在100 ml以上，如若臨床可提取量較少，則應(yīng)全部送檢，重復(fù)送檢可在一定程度上提高陽性檢出率。本研究中，254例樣本均完成ALK免疫組化檢測，且細胞蠟塊與活檢組織兩種樣本中的檢測結(jié)果具有一致性。這說明采用細胞學(xué)樣本進行ALK檢測，其結(jié)果真實可靠，可作為輔助診斷的良好平臺。目前，細胞學(xué)樣本ALK免疫組化檢測結(jié)果的判讀主要參照組織學(xué)樣本ALK檢測判讀標(biāo)準(zhǔn)，對細胞蠟塊中的成團細胞進行判讀，如果成團細胞個數(shù)≥5即可判讀為陽性[8]。

免疫組化、FISH和基于序列特異性的PCR檢測均可作為ALK陽性NSCLC的診斷技術(shù)[9]。在利用細胞蠟塊檢測ALK時，必須含有足夠多的腫瘤細胞，F(xiàn)ISH檢測中要求最少含有50個腫瘤細胞，免疫組化則沒有明確定義[10]。本研究中，細胞蠟塊免疫組化ALK陽性患者進一步行FISH檢測，結(jié)果顯示ALK基因重排同樣陽性。這也證實，細胞蠟塊ALK檢測不同方法之間的結(jié)果具有一致性，在實際應(yīng)用中，可根據(jù)具體情況選擇其中一種檢測技術(shù)。有研究表明，ALK抑制劑能夠通過抑制ALK基因相關(guān)信號通路發(fā)揮抑癌效應(yīng)[11]。本研究中接受ALK-TKI治療者，一定時間后可達到完全緩解或部分緩解。在細胞數(shù)量充足條件下制備細胞蠟塊進行ALK融合基因檢測，能夠更簡便、更精準(zhǔn)的診斷肺癌分型，進而給予個性化醫(yī)療。聯(lián)合常規(guī)HE染色、免疫組化和分子檢測，分析藥物靶標(biāo)、耐藥機制、免疫檢查點和異質(zhì)性的鑒定，有利于多元化綜合診斷。

綜上所述，細胞學(xué)樣本可以作為ALK基因突變檢測的重要樣本來源，其檢測結(jié)果可靠，可以作為臨床用藥的重要依據(jù)。