黃敏 許超 黃華云 黃華棟 李冬輝

視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）是一種免疫介導(dǎo)的以視神經(jīng)與脊髓同時或相繼受累為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘病變[1]。研究表明，NMO患者體內(nèi)會伴隨出現(xiàn) αβ-晶狀體蛋白（crystallin-αβ，Cryab）表達(dá)異常[2]。Cryab具有神經(jīng)保護(hù)作用，當(dāng)視神經(jīng)出現(xiàn)病變，外周血中Cryab水平會發(fā)生明顯改變[3]。同時NMO患者常合并廣泛的腦部損害與異常，臨床常使用MRI檢測對其進(jìn)行診斷評價(jià)[4]。雖然NMO患者在發(fā)病初期顱腦MRI圖像與正常人群沒有明顯差異，但隨著疾病發(fā)展可在顱腦部特定區(qū)域產(chǎn)生諸如“云霧樣”“鉛筆芯樣”等特定樣強(qiáng)化病灶，成為臨床鑒別和診斷NMO的重要依據(jù)[5]。而對于顱腦MRI的判定需要在掃描結(jié)束后由專業(yè)人員完成，以檢測顱腦病變情況。本研究通過分析NMO患者的外周血Cryab變化和MRI診斷信息，探討兩者對NMO的診斷價(jià)值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2019年1月至2020年2月長興縣人民醫(yī)院收治的NMO患者53例作為NMO組，所有患者均參照Wingerchuk等[6]發(fā)表的NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)予以確診。其中男 18 例，女 35 例；年齡 18～60（45.14±12.71）歲；病程2 d～5年，平均（2.7±0.6）年。選取同期在本院門診進(jìn)行健康體檢的健康志愿者50例作為對照組，其中男20例，女 30 例；年齡 19～58（44.22±15.42）歲。兩組研究對象性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過（IV-H3130000-011A），所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 總蛋白抽提試劑盒購自美國Hyclone公司；Cryab一抗購自美國BioLegend公司；羊抗兔二抗購自美國CST公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo公司；高效顯影膠片、顯影液、定影液購自德國柯達(dá)公司；ECL-Plus試劑及聚乙烯二氟（PVDF）膜購自美國Millipore公司；倒置顯微鏡購自德國Olympus生命科學(xué)公司；-80℃冰箱購自美國Thermo公司；高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 外周血Cryab表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。主要步驟如下：空腹?fàn)顟B(tài)下，收集研究對象外周血作為樣本，采用總蛋白抽提試劑盒提取全血的蛋白質(zhì)，并采用BCA定量法測定蛋白濃度。蛋白定量后，配置為1 μg/μl的蛋白溶液。配置濃縮膠、分離膠和緩沖液，以10 μl/孔的用量將蛋白溶液上樣于濃縮膠，運(yùn)用濕轉(zhuǎn)法，90 V恒壓電泳80 min，電泳后，不同分子量的蛋白被分開。麗春紅染液確認(rèn)分離效率，并將分離后的蛋白印跡電轉(zhuǎn)印至0.22 μm孔徑的PVDF膜，轉(zhuǎn)印條件為80 V×60 min。電轉(zhuǎn)印結(jié)束，5%的脫脂牛奶封閉非特異性抗體，加入一抗（3%的脫脂牛奶配置，濃度1∶2 000），4℃孵育過夜，次日，TBST 洗膜后加入二抗（濃度 1∶2 500），室溫孵育90 min。抗體孵育后采用ECL發(fā)光試劑盒顯色，初步觀察目的條帶，目的條帶清晰者轉(zhuǎn)入暗室進(jìn)行膠片顯影，所得膠片掃描為灰度圖，并用圖像分析軟件Image J 6.0對圖像進(jìn)行灰度分析。外周血Cryab的表達(dá)檢測委托杭州歐蒙未一醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3.2 MRI檢查方法 采用1.5T MR掃描儀（荷蘭飛利浦公司）對患者顱腦進(jìn)行MRI掃描分析。8通道頭顱正交線圈，橫斷面雙回波T2WI掃描。參數(shù)設(shè)置：TR：3 000 ms，TE：25/29 ms，ETL：8，NEX：2，矩陣：256×256。橫斷面、矢狀位、冠狀位液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列（FLAIR）T2WI掃描，參數(shù)設(shè)置：TR：9 600/1 718 ms，TE：100 ms，TI：2 400 ms，NEX：1，矩陣：256×192。橫斷面 FLAIR T1WI掃描，參數(shù)設(shè)置：TR：2 000 ms，TE：6.9 ms。將顱腦 MRI影像出現(xiàn)特定樣強(qiáng)化病灶判定為NMO陽性，然后計(jì)算MRI檢查對NMO診斷的靈敏度和特異度。

2 結(jié)果

2.1 外周血Cryab表達(dá)對NMO的診斷效能 NMO組患者外周血Cryab表達(dá)水平為0.825±0.251，高于對照組的 0.305±0.077，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。典型樣品Western blot顯影見圖1。外周血Cryab表達(dá)對NMO的診斷價(jià)值相對較高，AUC=0.840，P＜0.01，最佳截點(diǎn)值為0.594，靈敏度為0.774，特異度為0.860，見圖2。

圖1 兩組研究對象外周血αβ-晶狀體蛋白（Cryab）表達(dá)的電泳圖[對照組1和對照組2為對照組的兩個典型樣品，視神經(jīng)脊髓炎（NMO）組1和NMO組2為NMO組的兩個典型樣品]

圖2 外周血αβ-晶狀體蛋白（Cryab）表達(dá)診斷視神經(jīng)脊髓炎（NMO）的ROC曲線

2.2 MRI檢測情況分析 MRI檢查顯示，NMO陽性36例，陰性67例；MRI檢查對NMO診斷的靈敏度、特異度分別為 0.679（36/53）、1.000（50/50），見表 1。圖 3 為 MRI檢查中典型的陽性結(jié)果，相比于正常的顱腦MRI，陽性結(jié)果會在顱腦特定區(qū)域出現(xiàn)“云霧樣”“鉛筆芯樣”強(qiáng)化病灶。

圖3 MRI檢查中典型的陽性結(jié)果圖（a：“云霧樣”強(qiáng)化病灶；b：“鉛筆芯樣”強(qiáng)化病灶）

表1 MRI檢測情況分析（例）

2.3 外周血Cryab聯(lián)合MRI檢測對NMO診斷的一致性評價(jià) 外周血Cryab聯(lián)合MRI檢查對NMO診斷的靈敏度、特異度分別為 0.755（40/53）、1.000（50/50），見表2。相比于單獨(dú)檢測，兩者聯(lián)合檢測的靈敏度與特異度均得到較大提高，且與臨床確診結(jié)果的一致性處于良好水平（Kappa=0.749）。

表2 外周血Cryab聯(lián)合MRI檢測情況分析（例）

3 討論

NMO又被稱為Devic綜合征，是由一組體液免疫參與的抗原-抗體介導(dǎo)的嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)特發(fā)性炎性脫髓鞘性疾病，發(fā)病過程中患者常常伴隨視神經(jīng)炎和脊髓炎反復(fù)發(fā)作，由于臨床研究對NMO的認(rèn)識不足，缺乏良好診斷的依據(jù)，導(dǎo)致患者臨床診斷與治療效果較差[7-8]。研究表明，早期有效診斷可以明顯降低NMO復(fù)發(fā)率和致殘率，對于治療NMO具有極大的意義[9]。

NMO發(fā)病過程中主要損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞[10]，對星形膠質(zhì)細(xì)胞起保護(hù)作用的Cryab就成為一個研究熱點(diǎn)。Cryab是晶狀體中的主要蛋白成分之一，屬于小分子熱休克蛋白家族[11]，與多種眼科疾病如白內(nèi)障[12]、NMO[13]等的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。研究Cryab在不同疾病中的表達(dá)狀態(tài)能為疾病預(yù)防和治療提供一定的理論依據(jù)[14]，相關(guān)研究顯示，視神經(jīng)病變患者Cryab呈現(xiàn)出異常升高的狀態(tài)[15-16]，與本研究結(jié)果基本一致。此外，本研究結(jié)果顯示Cryab表達(dá)診斷NMO的靈敏度和特異度分別為0.774和0.860，進(jìn)一步證實(shí)了其診斷學(xué)價(jià)值。由于NMO的發(fā)病過程中會伴隨感覺減退甚至消失、四肢乏力、行走困難等中樞神性系統(tǒng)病變的特征，顱腦局部病變也是NMO的一個重要發(fā)病征象，既往研究指出，NMO患者的神經(jīng)病變主要集中在大腦皮質(zhì)下及深部腦白質(zhì)、脊髓束、胼胝體等與視神經(jīng)相關(guān)的神經(jīng)區(qū)域，病變形態(tài)大多數(shù)也呈現(xiàn)為斑片樣、點(diǎn)狀或類圓狀[17-18]。本研究結(jié)果也顯示NMO患者在MRI掃描中出現(xiàn)顱內(nèi)、視神經(jīng)內(nèi)病灶的部分強(qiáng)化，因此需要對NMO患者進(jìn)行MRI檢查輔助診斷[19]。本研究顯示MRI檢查對NMO診斷的靈敏度、特異度分別為0.679和1.000；根據(jù)特異度的表現(xiàn)，證實(shí)對于NMO的診斷，MRI檢查必不可少，能夠與其他疾病較好地區(qū)分開；但同時根據(jù)MRI檢查在靈敏度上的表現(xiàn)，說明對于NMO的診斷，單一的MRI檢查尚不足以滿足臨床診斷所需。因此本研究集兩者之優(yōu)勢，考察了Cryab表達(dá)聯(lián)合MRI檢測對NMO的診斷效能，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合檢測的靈敏度和特異度分別為0.775和1.000。

綜上所述，外周血Cryab聯(lián)合MRI檢測能夠更加有效診斷NMO，對于早期有效診斷NMO具有極其重要的價(jià)值。同時兩者聯(lián)合檢測還能夠及時反映疾病發(fā)展情況，利于為疾病的治療提供更為科學(xué)的診斷依據(jù)，提升NMO患者的臨床診治水平。