丁潤(rùn)波,馬 斌,花 蕾,郭 磊,杜青霞

(甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州 730000)

茄尼醇是煙草中含有的多萜類化合物[1-2]，一種不飽和的聚異戊二烯醇，呈白色固體粉末，弱極性，有較高的藥用價(jià)值，具有抗菌、消炎和止血等藥理作用，也是合成輔酶Q10、維生素K2、抗癌增效劑SDB等的重要原料[3-4].目前茄尼醇萃取方法有溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法[5-6]、超聲波輔助萃取[7]、微波萃取[8]、勻漿萃取、膜分離法等.高純度茄尼醇的獲取主要通過(guò)柱層析法、聚合態(tài)共沉淀法、大孔吸附樹脂法等.超臨界 CO2萃取技術(shù)是一種綠色、環(huán)保的新型高效分離技術(shù),廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域，該工藝操作周期短、無(wú)溶劑殘留，CO2無(wú)毒易得，較低的萃取溫度對(duì)有效成分影響小.通過(guò)改變萃取條件或加入夾帶劑能強(qiáng)化超臨界流體的溶劑能力或選擇性，提高目標(biāo)產(chǎn)物萃取率，因此在天然產(chǎn)物萃取方面顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)及廣闊的應(yīng)用前景[9-10].

我國(guó)是煙草生產(chǎn)大國(guó)，長(zhǎng)期以來(lái)產(chǎn)生的煙末都沒(méi)有得到重視，這不僅造成環(huán)境污染，而且浪費(fèi)資源.本文采用響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2萃取茄尼醇的萃取實(shí)驗(yàn)參數(shù)，更直觀地探討萃取條件以及夾帶劑對(duì)萃取過(guò)程的影響及其交互效應(yīng)，并結(jié)合柱色譜法對(duì)茄尼醇進(jìn)一步純化研究，旨在為茄尼醇高效萃取提供科學(xué)參考.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器及試劑

超臨界萃取裝置SPEED SFE (美國(guó) Applied Separations公司)；ESPEC電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (日本愛(ài)斯佩克公司)；DFW-300C高速粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；梅特勒MS303TS(0.001 g)電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Waters UPLC高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；工業(yè)級(jí)CO2氣體(蘭州裕隆氣體股份有限公司)；ZF-6三用紫外線分析儀(上海金鵬分析儀器有限公司)；DL-720B超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司);Heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)海道爾夫公司)；閃式層析柱(欣維爾公司)；KL05A高速離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)；薄層色譜硅膠板(青島海洋化工廠)、硅膠(200-300目，青島海洋化工廠)；95%乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚均為分析純，甲醇，乙醇為色譜純；茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-Aldrich公司).

1.2 原料及預(yù)處理

煙末粉碎后，過(guò)20目篩(粒徑控制在20～40目)，所用設(shè)備要求不小于40目，否則有可能堵塞管路；加入超純水浸泡并置于超聲清洗器中(功率60 W，溫度40 ℃)作用1 h，以減少其他成分如煙堿、蛋白質(zhì)、尼古丁等對(duì)萃取物純度的影響，抽濾并反復(fù)淋洗,濾渣加入飽和的醇鈉溶液進(jìn)行皂化反應(yīng)，超聲波清洗器(功率90 W，溫度60 ℃)作用2 h，再用硫酸調(diào)節(jié)pH 至中性后抽濾，濾渣干燥后備用.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)所用反應(yīng)釜(萃取釜)規(guī)格為1 L.準(zhǔn)確稱取50 g處理后的煙末，置于1 L萃取釜中，按照文獻(xiàn)報(bào)道夾帶劑對(duì)萃取效果的影響[11]，固定95%的乙醇作為夾帶劑，二氧化碳流量為2 L/min，在設(shè)定的溫度和壓力下進(jìn)行超臨界萃取，萃取時(shí)間固定為1.5 h.萃取結(jié)束后，從收集瓶中取出萃取物，用95%乙醇溶解,并定容至刻度,靜置后移取200 μL至5 mL容量瓶,用95%乙醇定容至刻度.樣品經(jīng)0.225 μm微孔濾膜過(guò)濾,用高效液相色譜儀進(jìn)行分析[12]，測(cè)定茄尼醇的萃取率.萃取率為萃取液中茄尼醇含量與煙葉中茄尼醇的含量的比值，本實(shí)驗(yàn)煙末中茄尼醇含量為0.641%.

高效液相色譜(HPLC)法分析條件如下：色譜柱：Symmetry C18柱 (250 mm×4．6 mm，5 μm )； 流動(dòng)相：甲醇∶異丙醇 (45∶55)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 m L/min；進(jìn)樣量：20 μL.

1.4 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

參照單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果[13-14]，根據(jù)影響超臨界流體動(dòng)態(tài)萃取的因素及參數(shù)范圍，采用Minitab 16.0軟件的 Box-Behnken模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析.選取萃取壓力(A)、萃取溫度(B)、夾帶劑流量(C)設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化煙末中茄尼醇的超臨界萃取條件.CO2流量對(duì)茄尼醇萃取率的影響研究相對(duì)較多，研究表明隨著CO2流量的增加，萃取量逐漸增加并最終保持平穩(wěn)；本研究設(shè)定了相對(duì)充足的萃取時(shí)間，以保證萃取物充分提取，因此選擇了萃取壓力、萃取溫度和夾帶劑流量3個(gè)因素.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1.

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素及水平

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果

優(yōu)化過(guò)程選用三因素三水平展開(kāi)，以茄尼醇萃取率作為響應(yīng)值，共執(zhí)行17組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2.

2.2 響應(yīng)面模型方程的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Minitab 16.0 軟件，對(duì)表2中茄尼醇萃取率進(jìn)行多元回歸擬合，獲得茄尼醇萃取率對(duì)萃取壓力(A)、萃取溫度(B)和夾帶劑流量(C)的二次多元回歸方程：

表2 萃取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

Y=70.859-1.446×A-1.142×B-
2.185×C-14.911×A×B-2.712×A×C-
17.474×B×C+3.747×A2-
5.711×B2+ 1.332×C2.

方差分析結(jié)果如表3.

表3 方差分析結(jié)果

2.3 響應(yīng)面模型交互作用分析

由各因素間的響應(yīng)面圖及等高線圖可以直觀的找到響應(yīng)面的最高點(diǎn)，評(píng)價(jià)各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，以及確定各個(gè)因素的最佳水平范圍.響應(yīng)曲面越陡，說(shuō)明兩因素間交互作用就越強(qiáng)；若響應(yīng)曲面的顏色越深，說(shuō)明結(jié)果越顯著.萃取壓力和萃取溫度交互作用的響應(yīng)面及等高線如圖1、圖2.

圖1、圖2表明，夾帶劑的流量設(shè)置為0.2 mL/min，萃取壓力和萃取溫度的交互作用對(duì)茄尼醇萃取率的影響，可知萃取壓力約在20 MPa，萃取溫度略低于55 ℃時(shí)，響應(yīng)值達(dá)到最高點(diǎn)，萃取壓力對(duì)萃取率的影響大于溫度的影響.

圖1 萃取壓力和萃取溫度交互作用的響應(yīng)面

圖2 萃取壓力和萃取溫度交互作用的等高線

萃取溫度設(shè)置為53 ℃，萃取壓力和夾帶劑流量的交互作用對(duì)茄尼醇萃取率的影響如圖3、圖4所示.夾帶劑流量約為0.2 mL/min，萃取壓力在20 MPa附近時(shí)，響應(yīng)值達(dá)到最高點(diǎn)，夾帶劑流量對(duì)萃取率的影響大于萃取壓力的影響.

圖3 萃取壓力和夾帶劑流量交互作用的響應(yīng)面

圖4 萃取壓力和夾帶劑流量交互作用的等高線

萃取壓力設(shè)置為25 MPa，萃取溫度和夾帶劑流量的交互作用對(duì)茄尼醇萃取率的影響圖5、圖6所示，夾帶劑流量約為0.2 mL/min附近，萃取溫度略高于50 ℃時(shí)，響應(yīng)值達(dá)到最高點(diǎn)，夾帶劑流量對(duì)萃取率的影響大于萃取溫度的影響.綜合來(lái)看，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響顯著性表現(xiàn)為夾帶劑流量>萃取壓力>萃取溫度.

圖5 萃取溫度和夾帶劑流量交互作用的響應(yīng)面

圖6 萃取溫度和夾帶劑流量交互作用的等高線

可見(jiàn)，夾帶劑流量的影響最為顯著，隨著夾帶劑流量的升高，茄尼醇萃取率增加，當(dāng)夾帶劑流量繼續(xù)增大時(shí)，茄尼醇萃取率則明顯下降，表現(xiàn)為曲面較陡；萃取溫度和萃取壓力對(duì)萃取率的影響次之，響應(yīng)面較緩和.

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

用軟件求得模型的最大預(yù)測(cè)值為71.47%，此時(shí)茄尼醇萃取實(shí)驗(yàn)的參數(shù)為萃取壓力19.1 MPa，萃取溫度為51.3 ℃，夾帶劑流量為0.19 mL/min.為驗(yàn)證該模型的可靠性，考慮到實(shí)際可操作性，將萃取實(shí)驗(yàn)條件修正為萃取壓力19 MPa，萃取溫度51 ℃，夾帶劑流量為0.2 mL/min，多次測(cè)量后實(shí)測(cè)值平均達(dá)到 69%.該值與數(shù)學(xué)模型優(yōu)化得到的理論值相近，表示該模型對(duì)茄尼醇的萃取實(shí)驗(yàn)優(yōu)化具有一定的實(shí)際價(jià)值.

2.5 純化實(shí)驗(yàn)

稱取一定量的萃取物，加石油醚溶解，濕法上樣，緩慢加入層析柱，石油醚、乙酸乙酯為洗脫劑，通過(guò)硅膠柱層析予以純化，薄層色譜監(jiān)測(cè)(薄層條件∶石油醚∶乙酸乙酯=4∶1)，紫外分析儀顯色.粗品中有大量與茄尼醇極性相似的蠟狀物質(zhì)，洗脫過(guò)程中先用石油醚沖洗，有助于分離蠟質(zhì).洗脫劑(石油醚∶乙酸乙酯)的極性的梯度從1∶100緩慢增加到1∶8，觀察色帶，待前兩個(gè)黃色色帶沖出后，試管收集洗脫液，點(diǎn)樣并與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，合并相同組分.減壓濃縮后，經(jīng)高效液相分析，含量達(dá)到83%.蠟質(zhì)與茄尼醇分離較好時(shí)，收集洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后析出微黃色固體，分離不完全時(shí)，濃縮后易呈現(xiàn)淡黃色漿狀物.

文獻(xiàn)[15]報(bào)道了甲醇、乙腈及丙酮等溶劑都可以實(shí)現(xiàn)茄尼醇重結(jié)晶，其中甲醇的效果最好，綜合分析后本研究采用甲醇與石油醚、乙腈、丙酮3種組合雙溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，結(jié)果如表4.結(jié)果表明，用甲醇-丙酮雙溶劑重結(jié)晶得到的茄尼醇效果最好，能將純度提升至93.2%.

表4 混合溶劑茄尼醇重結(jié)晶效果

3 結(jié)論

研究了用超臨界CO2萃取技術(shù)從煙末中萃取茄尼醇的實(shí)驗(yàn)條件，為了保證萃取物提取充分，設(shè)定了相對(duì)充足的萃取時(shí)間，因此選擇了萃取壓力、萃取溫度和夾帶劑流量3個(gè)影響因素.采用響應(yīng)面優(yōu)化萃取條件(萃取壓力、萃取溫度、夾帶劑流量)，利用響應(yīng)面法建立了以茄尼醇提取率為響應(yīng)值的二次模型，該模型方差顯著，失擬項(xiàng)不顯著，決定系數(shù)高(R2=99.70%).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C提取的最佳實(shí)驗(yàn)條件為:萃取壓力19 MPa，萃取溫度53 ℃，夾帶劑的用量為0.19 mL/min.通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該參數(shù)條件下萃取茄尼醇萃取的真實(shí)值與理論值相近，具有一定的實(shí)際價(jià)值.優(yōu)化后的過(guò)程具有周期短、提取效率高、粗提物黏稠性較低、雜質(zhì)少等優(yōu)勢(shì)，有利于進(jìn)一步上柱純化和結(jié)晶，具有較好的應(yīng)用前景.還研究了茄尼醇粗品的純化方法，通過(guò)柱層析分離結(jié)合重結(jié)晶得到高純度的茄尼醇，為后續(xù)的純化工作提供一定的參考.