王南，宋銀森

(河南中醫(yī)藥大學人民醫(yī)院/鄭州人民醫(yī)院 轉化醫(yī)學研究中心，河南 鄭州 450014)

下呼吸道感染是最常見的感染性疾病，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。及時進行下呼吸道感染病原體檢測有助于臨床準確診斷及合理用藥，對控制感染發(fā)揮至關重要的作用。傳統(tǒng)病原體檢測方法包括涂片鏡檢、細菌培養(yǎng)和血清學試驗等，這些方法操作繁瑣、靈敏度及特異性不足，其中細菌培養(yǎng)需嚴格環(huán)境條件且耗時較長[2-3]。實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)在對單靶標核酸檢測時，具有靈敏度和特異性高的特點，但每次僅能檢測1種病原體，效率低并且成本較高[4-5]。近年來，環(huán)介導恒溫擴增法(loop mediated isothermal amplification，LMAP)作為一種操作簡便、快速準確且經濟的分子診斷技術，可同時并行檢測多種核酸靶基因，被廣泛應用于病原體檢測[6-9]。本研究分析下呼吸道感染患者肺泡灌洗液的病原體檢出情況，評價肺泡灌洗液LAMP在下呼吸道感染病原體檢測中的價值，為臨床及時準確鑒定病原體提供一種可靠的診斷依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020年4月至2021年4月于鄭州人民醫(yī)院就診的465例疑似下呼吸道感染患者，標本類型為肺泡灌洗液，其中男281例，女184例，年齡13～95歲，平均(61.82±18.20)歲。(1)納入標準：①以發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難及肺部感染等為主要臨床表現(xiàn)，診斷標準參照《醫(yī)院感染管理規(guī)范》[10]；②胸部X片或者CT等影像學結果提示下呼吸道感染。(2)排除標準：①標本鏡檢不合格培養(yǎng)出的菌株；②因非感染因素導致的下呼吸道影像學改變，如肺水腫、肺癌及心力衰竭等。

1.2 核酸提取及LAMP檢測核酸提取步驟參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書(北京博奧)。呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒采用恒溫擴增技術，結合微流控碟式芯片，利用熒光染料摻入法在分析儀上進行恒溫(65 ℃)反應和實時熒光分析，在具有鏈置換功能的聚合酶作用下，陽性樣本擴增曲線呈類似“S”形，通過 RTisochipTM-A 恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀(北京博奧)和配套軟件分析并進行結果判讀，可同時檢測多種病原體核酸靶基因。

1.3 細菌分離培養(yǎng)及鑒定標本接種培養(yǎng)及菌種鑒定按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行操作，用VITEK-32全自動細菌分析儀(法國梅里埃)對純培養(yǎng)后的優(yōu)勢菌落進行鑒定。

1.4 統(tǒng)計學方法應用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數資料用百分數表示；采用McNemarχ2檢驗分析LAMP法與細菌培養(yǎng)法檢測結果陽性率的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；兩種檢測方法結果一致性分析采用Kappa分析，Kappa>0.4表明結果具有一致性。

2 結果

2.1 LAMP檢出病原體的分布情況465例患者肺泡灌洗液標本中，LAMP檢出陽性171例，陽性率為36.77%(171/465)，其中單一病原體感染116例，混合感染55例，分別占總感染陽性例數的67.84%和32.16%。感染病原體以耐甲氧西林葡萄球菌(11.40%)和鮑曼不動桿菌(9.25%)為主，其他病原體陽性率較高的有肺炎克雷伯菌(8.60%)、銅綠假單胞菌(7.10%)、結核分枝桿菌復合菌(5.59%)、嗜肺軍團菌和肺炎支原體陽性率最低均為0.22%。單一病原體感染中結核分枝桿菌復合菌(92.31%)和肺炎鏈球菌(82.35%)陽性率較高。在耐甲氧西林葡萄球菌陽性病例中，單一感染和混合感染占比大致相等，而以金黃色葡萄球菌為主的混合感染病例占90.91%。見表1。

表1 LAMP對病原體的檢出情況

2.2 細菌培養(yǎng)結果465例患者肺泡灌洗液標本中，細菌培養(yǎng)結果檢出91例陽性，陽性率為19.57%(91/465)。各病原體檢出陽性率較低，其中鮑曼不動桿菌(8.39%)、肺炎克雷伯菌(7.53%)、銅綠假單胞菌(4.95%)和金黃色葡萄球菌(1.94%)占比較高，未培養(yǎng)出流感嗜血桿菌、耐甲氧西林葡萄球菌和嗜肺軍團菌。見表2。

表2 細菌培養(yǎng)鑒定結果

2.3 LAMP檢測和細菌培養(yǎng)對病原體檢出率的比較465例患者的肺泡灌洗液標本，LAMP檢出陽性171例，陰性294例，陽性率為36.77% (171/465)；細菌培養(yǎng)結果為91例陽性，374例陰性，陽性率19.57%。肺泡灌洗液LAMP檢出陽性率高于細菌培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=69.344，P<0.001)。

2.4 LAMP和細菌培養(yǎng)對病原體檢測結果一致性分析在171例LAMP檢測為陽性的樣本中，86例細菌培養(yǎng)結果陽性；在294例LAMP檢測陰性的樣本中，有5例樣本細菌培養(yǎng)結果陽性。兩種方法在病原體檢測中有375例樣本結果一致，一致率為80.65%(375/465)，其中鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌的一致性較好，Kappa值分別為0.813、0.810、0.769和0.725。見表3。

表3 LAMP檢測與細菌培養(yǎng)對病原體檢測結果一致性分析

3 討論

下呼吸道感染是最致命的疾病之一。據統(tǒng)計，2016年下呼吸道感染導致5歲以下兒童死亡人數約65萬，所有階段的成年人死亡人數高達238萬[11]。LAMP檢測采用多指標并行檢測，能夠減少污染并且具有高靈敏度和低檢測限等優(yōu)點，實現(xiàn)了病原體的快速診斷[12-15]。本研究中肺泡灌洗液LAMP檢測陽性率高于細菌培養(yǎng)陽性率，與以往研究[16]一致，說明采用肺泡灌洗液LAMP檢測方法可以提高病原體的檢出率，在臨床應用中更具一定的優(yōu)勢。

合格的樣本是下呼吸道感染病原體準確檢測的關鍵。痰液作為最主要且最容易獲取的標本很容易被上呼吸道正常菌群影響，并且整個長時間培養(yǎng)過程中也易被污染[17-18]。此外患者進行該檢測前使用抗菌藥物也會降低陽性檢出率[19]。但是，上呼吸道正常菌群污染無法避免，結果應結合標本來源與疾病情況等綜合考慮判斷。與痰液相比，肺泡灌洗液較少受上呼吸道正常菌群的污染，取得樣本質量更高，檢出率及合格率也更高[20]。因此，基于肺泡灌洗液標本類型檢測感染病原體核酸可能會更準確地評估LAMP的檢測性能，為臨床準確區(qū)分定植菌與致病菌提供更可靠的診斷依據。本研究結果顯示，肺泡灌洗液LAMP和細菌培養(yǎng)法檢測病原體結果一致率為80.65%，其中鮑曼不動桿菌(Kappa=0.813)、銅綠假單胞菌(Kappa=0.810)、金黃色葡萄球菌(Kappa=0.769)及肺炎克雷伯菌(Kappa=0.725)的一致性較好。與既往相關研究[19,21-29]相比，肺泡灌洗液LAMP檢測與細胞培養(yǎng)結果的一致性較好，提示肺泡灌洗液LAMP檢測可作為下呼吸道感染病原體診斷的最適方案。

本研究結果也顯示，171例肺泡灌洗液LAMP檢測為陽性，85例細菌培養(yǎng)結果陰性；有5例肺泡灌洗液細菌培養(yǎng)為陽性，而LAMP檢測結果為陰性。產生上述結果的原因可能是樣本中細菌在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)死亡，導致培養(yǎng)結果陰性；其次，樣本中病原體核酸水平太低未達到檢測限可能會出現(xiàn)結果假陰性，或者非特異性擴增導致結果假陽性；另一方面，LAMP檢測可能會遺漏一些特殊病原體，并且已開發(fā)的相關檢測試劑盒包含檢測的病原體種類有限。

引起下呼吸道感染的病原體比較復雜，臨床患者會存在單一感染和復合感染，且癥狀也基本相似，傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)很難準確診斷，LAMP則可以同時檢出多種病原體。本研究結果顯示，單一感染中主要以耐甲氧西林葡萄球菌(11.40%)和鮑曼不動桿菌(9.25%)為主，38.01%的感染為混合感染，其中以金黃色葡萄球菌為主的混合感染占90.91%，在耐甲氧西林葡萄球菌陽性病例中，單一感染和混合感染的比例相近。這也進一步提示LAMP檢測結果可作為對細菌培養(yǎng)結果的補充，有助于臨床考慮混合感染的可能性，減少抗生素的不合理應用。

綜上所述，肺泡灌洗液LAMP檢測可以提高下呼吸道感染病原體的檢出率，當細菌培養(yǎng)無法檢測到患者體中病原體情況下，肺泡灌洗液LAMP可作為一種快速有效的檢測方法確定病原體種類，為臨床診療提供有價值的參考。