康研，陳珍珠，趙媛，何思曉，馬雪潔，劉青青，陳禪友，潘磊

（江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心；湖北省食用豆類植物自然科技資源中心，湖北武漢 430056）

0 引言

豇豆［Vigna unguiculata（L.）Walp.］為豆科豇豆屬草本植物。作為一種重要豆類作物，豇豆耐高溫干旱，在世界范圍內(nèi)種植廣泛，包括非洲、亞洲、歐洲、美國南部地區(qū)等。豇豆是我國的優(yōu)勢豆類蔬菜作物之一，嫩莢和種子均可食用。因其營養(yǎng)豐富，既可鮮食，又適合加工，深受消費者青睞。由于播種季節(jié)長，生產(chǎn)周期短，對于我國8-9月夏秋蔬菜淡季市場的蔬菜供應(yīng)具有重要作用。

采用DNA分子標(biāo)記技術(shù)研究豇豆種質(zhì)資源的遺傳變異是當(dāng)前關(guān)注的研究熱點之一。利用顯性分子標(biāo)記技術(shù)如RAPD（random amplified polymorphic DNA）、ISSR（inter-simple sequence repeat）等在豇豆的研究中，已經(jīng)篩選獲得一批重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠的分子標(biāo)記引物［1-2］。而在豇豆的共顯性分子標(biāo)記研究方面，如SSR（simple sequence repeat）和SNP（single nucleotide polymor?phism）等分子標(biāo)記的發(fā)掘則報道愈來愈多。從長豇豆基因組數(shù)據(jù)庫HarvEST和CGKB（http：∥cowpeagenomics.med.virginia.edu/CGKB）中發(fā)掘出了172個多態(tài)性豇豆SSR分子標(biāo)記，包括45個EST-SSR標(biāo)記和127個SSR標(biāo)記［3-4］。有研究表明采用SNP標(biāo)記可定位一批與豇豆馴化相關(guān)的基因，包括莢長、花色、果柄長度、種皮顏色等［5-6］。目前研究所揭示的豇豆種質(zhì)資源的遺傳變異有限，豇豆的分子生物學(xué)研究還比較滯后，尤其是在長豇豆的DNA分子標(biāo)記研究方面還比較薄弱，亟待加強。

插入與缺失（InDel，insertion/deletion）標(biāo)記是一種共顯性分子標(biāo)記，在基因組上分布廣泛，密度大，適宜于進行全基因組分子標(biāo)記的發(fā)掘。InDel標(biāo)記可以通過凝膠電泳中的條帶大小差異來確定不同的基因型。隨著測序技術(shù)的發(fā)展以及各個物種參考基因組的公布，其InDel標(biāo)記開發(fā)的成本和難度也隨之降低，因此InDel標(biāo)記是近年來一種較為熱門的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源分析與分子輔助遺傳育種、群體遺傳分析、圖位克隆、基因定位及遺傳圖譜的構(gòu)建等研究［7-8］。李斯更等［9］基于黃瓜基因組重測序結(jié)果設(shè)計了全基因組分布的代表性InDel引物134對，其中具有多態(tài)性的引物116對，占引物總數(shù)的86.6%，116對引物充分揭示出16份種質(zhì)的多樣性和特異性。吉康娜等［10］通過茄子的全基因重測序數(shù)據(jù)，開發(fā)出具有多態(tài)性的62個InDel標(biāo)記，基于這62個InDel標(biāo)記聚類分析結(jié)果揭示出24份紫紅長茄自交系的遺傳多樣性，并對茄子品種純度進行鑒定，其結(jié)果與田間鑒定結(jié)果相吻合。

豇豆中InDel分子標(biāo)記的研究鮮見報道。本研究擬采用InDel分子標(biāo)記技術(shù)，檢測豇豆種質(zhì)資源的遺傳變異，聚類分析其親緣關(guān)系，嘗試構(gòu)建豇豆InDel分子指紋圖譜，以期為豇豆的分子評價、鑒定、保存和新品種選育等提供分子生物學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究中采用來自國內(nèi)外的24份豇豆品種材料，其中來自中國的有21份，美國的有2份和尼日利亞1份（表1）。

表1 24份豇豆品種材料的信息Tab.1 Information of 24 cowpea varieties

1.2 實驗方法

1.2.1 豇豆基因組總DNA的提取與檢測選取鮮嫩的豇豆葉片，加液氮將葉片迅速冷凍，并研磨成粉末，采用改良的CTAB法［11］，提取植物基因組總DNA。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，以LambdaDNA/HindIIIMarker為參照，檢測基因組總DNA的質(zhì)量和濃度。之后，將不同樣品材料的總DNA稀釋到30～50 ng/μL，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的篩選和PCR擴增本研究所用的3個InDel分子標(biāo)記引物序列由本實驗室自主設(shè)計。由生物工程（上海）股份有限公司合成引物，引物信息見表2。

表2 3個InDel分子標(biāo)記信息Tab.2 Information of 3 InDel molecular markers

1.2.3 PCR擴增體系InDel-PCR擴增中，PCR反應(yīng)總體系為20μL：正反引物各1μL（10 ng/μL），Mix Buffer 10μL（含TaqDNA聚合酶），ddH2O 7μL，模板DNA 1μL（30～50 ng/μL）。

PCR反應(yīng)在Eppendorf擴增儀上進行，擴增條件：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增完畢，取出放入冰箱，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 InDel-PCR擴增及檢測PCR擴增產(chǎn)物用35%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。在100 V恒壓電泳條件下，電泳30～45 min，置于全自動凝膠成像分析系統(tǒng)上拍照保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理

拍照記錄凝膠電泳的DNA圖譜。對于不同豇豆DNA樣品在瓊脂糖凝膠電泳統(tǒng)計時按照有條帶為1，無條帶為0的形式記錄，錄入Excel表格中生成0/1矩陣形式。用NTSYS pc2.1軟件對豇豆InDel分子標(biāo)記的0/1矩陣數(shù)據(jù)進行分子指紋圖譜構(gòu)建和UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物擴增條帶多態(tài)性結(jié)果分析

本研究利用3對InDel引物（VuFC30、VuFC33和VuFC34），共檢測出6條多態(tài)性條帶，多態(tài)性位點比率為100%，平均每個引物擴增2條多態(tài)性條帶（見圖1）。

圖1 InDel引物VuFC30（A）、VuFC33（B）和VuFC34（C）檢測24份豇豆材料的多態(tài)性電泳圖譜Fig.1 Polymorphism electrophoresis patterns of 24 cowpea cultivars detected by the InDel primers VuFC30(A)、VuFC33(B)and VuFC34(C)

InDel引物VuFC30檢測到2條多態(tài)性條帶，大小分別為170 bp和300 bp。其中條帶大小為170 bp的材料有20份，分別為X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X12、X13、X14、X17、X18、X19、X20、X21、X22和X23；條帶大小為300 bp的材料有2份（X15和X24）；X11和X16無條帶。

InDel引物VuFC33檢測到2條多態(tài)性條帶，大小分別為250 bp和320 bp。其中條帶大小為250 bp的 材料有7份，分 別為X1、X7、X10、X11、X12、X15和X19；條帶大小 為320 bp的材料 有17份，分別為X2、X3、X4、X5、X6、X8、X9、X13、X14、X16、X17、X18、X20、X21、X22、X23和X24。

InDel引物VuFC34檢測到2條多態(tài)性條帶，大小分別為210 bp和250 bp。其中條帶大小為210 bp的材料有17份，分別為X2、X3、X4、X5、X6、X8、X9、X10、X11、X13、X14、X17、X18、X19、X21、X22和X23；條帶大小為250 bp的材料有6份，分別為X1、X7、X12、X15、X20和X24；X16無條帶。

2.2 24個豇豆品種材料的聚類分析

遺傳相似性系數(shù)反映群體間的親緣關(guān)系，遺傳距離常用來表示樣本間遺傳分化的程度。供試的24份豇豆品種材料的Jaccard相似性系數(shù)變化范圍為0.20～1.00之間（圖2），說明其遺傳背景存在較大差異。

圖2 24份豇豆品種材料的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA cluster of the 24 cowpea cultivars

利用聚類分析可以明確材料間的遺傳差異，有助于合理選擇親本，充分利用種質(zhì)資源。聚類分析將24份材料大致分為3個亞群：亞群Ⅰ：共18份，豇豆樣品來源于湖北7份、遼寧3份、江蘇2份、北京1份、江西1份、山東1份、湖南1份和美國2份；亞群Ⅱ：共2份，豇豆樣品來源于遼寧1份和寧夏1份；亞群Ⅲ：共4份，豇豆樣品來源于湖北1份、遼寧2份和尼日利亞1份。從UPGMA聚類結(jié)果來看，聚類結(jié)果與其來源地之間沒有明顯的相關(guān)性，但是豇豆資源之間還是存在一定的遺傳分化。3份來自國外的豇豆品種材料之間能被區(qū)分開，說明供試的3份國外豇豆資源之間存在遺傳分化。3份國外豇豆材料與部分國內(nèi)豇豆品種無法區(qū)分。比如，兩份外國材料（JD-0049和JD-0053）中，JD-0053與亞群Ⅰ中其余2份國內(nèi)豇豆材料無法區(qū)分，與我國的部分豇豆材料尚未能完全區(qū)分；JD-0049與亞群Ⅱ中的JD-0066尚無法區(qū)分。在21份國內(nèi)豇豆材料中，有14份豇豆資源聚類在一個分支中無法區(qū)分，其原因可能是這些豇豆品種的遺傳背景相似，由于環(huán)境或人為因素使國內(nèi)不同地區(qū)的豇豆種質(zhì)間存在一定的基因流，也可能是3個InDel標(biāo)記檢測的位點太少所致。

2.3 豇豆品種材料InDel分子指紋圖譜構(gòu)建

供試的24份豇豆品種材料中，3個InDel分子標(biāo)記共檢測到8種類型的InDel分子指紋圖譜（表3）。InDel指紋類型1為010110，屬于此類型的有3份豇豆材料JD-0220、JD-0021和JD-0053。InDel指紋類型2為100110，有1份（JD-0060）豇豆材料屬于此類型。InDel指紋類型3為011001，有14份 豇 豆 材 料 屬 于 此 類 型，包 括JD-0001、JD-0003、JD-0006、JD-0008、JD-0019、JD-0023、JD-0028、JD-0055、JD-0056、JD-0064、JD-0065、JD-0093、JD-0098和JD-0101。InDel指 紋 類 型4為011010，包 含1份（JD-0074）豇 豆 材 料。InDel指 紋 類 型5為000101，包含1份（JD-0052）豇豆材料。InDel指紋類型6為010101，包含2份豇豆材料JD-0049和JD-0066。InDel指紋類型7為001000，包含1份（JD-0061）豇豆材料。InDel指紋類型8為101010，包含1份（JD-0105）豇豆材料。值得注意的是，在這8種InDel指紋類型中，有5份豇豆材料（JD-0052、JD-0060、JD-0061、JD-0074、JD-0105）檢測到其獨有的InDel指紋類型，可以與其他19份豇豆材料區(qū)分開。因此，這3個InDel分子標(biāo)記能用于豇豆品種資源的DNA分子指紋鑒定。

表3 24份豇豆品種材料的InDel分子指紋圖譜類型Tab.3 The fingerprint types of the InDel markers of the 24 cowpea cultivars /bp

3 討論

InDel標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，在整個基因組中，其分布頻率高，且變異穩(wěn)定性強［13］。隨著DNA測序技術(shù)的進步，測序的時間成本和經(jīng)濟成本逐漸降低，基于高通量重測序技術(shù)的InDel標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用發(fā)展迅速，已經(jīng)在作物研究中大量報道，包括大豆［14］、水稻［15］、番茄［16］、黃瓜［17］等。Adedze等［18］基于黃瓜的重測序數(shù)據(jù)，利用GATK等軟件從10 470個InDel標(biāo)記篩選出插入缺失片段>30 bp的InDel標(biāo)記385個，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測出211個具有多態(tài)性的InDel標(biāo)記，利用這些標(biāo)記成功地將48個黃瓜選育品系聚類為水果和普通黃瓜兩大類。但是，豇豆中的InDel研究鮮見報道。

本研究以從國內(nèi)外收集的24份豇豆種質(zhì)資源為試驗材料，采用InDel分子標(biāo)記技術(shù)，進行了豇豆種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和分子指紋圖譜研究。結(jié)果表明：相似性系數(shù)在0.20～1.00之間，揭示其遺傳變異較大，研究結(jié)果有利于豇豆的遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建等應(yīng)用研究；UPGMA聚類分析可將24份豇豆材料大致分為3個亞群，結(jié)果表明豇豆品種資源與其地理來源之間沒有明顯的相關(guān)性，但是能反映出部分豇豆資源之間的遺傳分化；對于本次供試的24個材料，使用3個InDel標(biāo)記檢測出8種類型的指紋圖譜，由于使用的InDel標(biāo)記較少無法將全部品種區(qū)分，但可為以后使用瓊脂糖凝膠電泳大規(guī)模開發(fā)豇豆InDel標(biāo)記提供基礎(chǔ)。由于傳統(tǒng)的InDel標(biāo)記檢測技術(shù)使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，其效率較低、實驗過程復(fù)雜、試劑安全性差，導(dǎo)致其檢測成本升高。本研究中的InDel標(biāo)記帶型易讀簡單，瓊脂糖凝膠電泳操作更為簡單快捷，更適合品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建。對于構(gòu)建指紋圖譜，由于InDel標(biāo)記的條帶清晰且數(shù)量少，即可使用引物組合法去鑒別相應(yīng)的品種，引物組合法通過不同引物的有限組合，可以大大提高引物的鑒別能力。

綜上，本研究結(jié)果可為今后豇豆雜交選育及雜交種間遺傳多樣性研究提供分子證據(jù)，可為后續(xù)開展優(yōu)良品種提供有效依據(jù)，對豇豆種質(zhì)資源的開發(fā)與利用有著重要意義。