劉 羽，王申能，羅瑭秋琦，管 鑫，宗 飛

(延安大學 石油工程與環(huán)境工程學院，陜西 延安 716000)

苯酚及其衍生物存在于各種化工行業(yè)產生的工業(yè)廢水中，作為一類原生質毒物，排放到環(huán)境中嚴重影響生態(tài)環(huán)境及人類的健康，因此，如何有效地處理含酚廢水，已成為環(huán)境污染領域重點關注的問題之一[1-2]。

酚類物質的去除可以采用物理、化學和生物方法。生物處理方法以其處理徹底、無二次污染等優(yōu)勢被廣泛研究和應用[3]。微生物固定化技術是指通過物理或化學的手段將游離的微生物吸附或包埋限定在一定的空間區(qū)域，保持其生物活性并能反復利用的方法[4-5]。被固定的細菌活性高、耐毒害能力強、降解污染物的效率高于游離狀態(tài)下的細菌，且固定化后可實現微生物快速高效分離，近年來被廣泛應用于含有機物廢水處理，并取得一定的效果，具有良好的應用前景[6-7]。微生物固定化方法有包埋法、交聯法、吸附法、共價結合法等[8]。以吸附法來固定化微生物，相比于包埋法和交聯法操作更簡單，效果也比較明顯。曹曉李等[9]人利用改性木屑固定化微球菌，研究了pH、溫度和振蕩速率對其降酚性能的影響。結果表明，木屑固定化細胞優(yōu)于游離細胞對環(huán)境的耐受能力和降酚速率。

我國核桃產量巨大，廢棄的核桃殼如能進行處理和回收利用，既能實現廢棄物的資源化，又能利用現有的綠色資源，降低廢水處理成本，增加了廢棄物循環(huán)利用帶來的產業(yè)效益[10]。實驗采用生物質核桃殼吸附固定微生物降解苯酚，考察按不同梯度投加固定化微生物對苯酚降解的影響及重復利用情況，通過研究生物質為載體固定苯酚降解菌，以期為解決治理環(huán)境中酚類物質的污染問題提供借鑒。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

本實驗使用的高效苯酚降解菌為實驗室保存的無色桿菌LQ-1(Achromobactersp.)，具有較好的苯酚降解性能。市售核桃殼，通過粉碎后人工篩選得到不同粒徑的固定化材料，如圖1所示。

圖1 不同粒徑核桃殼

蛋白胨、酵母浸粉和瓊脂粉(北京奧博星生物技術有限公司)。氯化鈉、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、氯化銨(NH4Cl)、氯化鈣(CaCl2)、苯酚、氨水、鐵氰化鉀、4-氨基安替比林、氫氧化鈉、無水乙醇和鹽酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)，所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UVmini-1240紫外可見分光光度計(日本島津公司)；LS-30立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊公司)；HR/T20M高速冷凍離心機(湖南赫西公司)；BCM-1300A生物潔凈工作臺(蘇凈公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 核桃殼的預處理

市售核桃殼用蒸餾水洗凈，在100℃干燥8 h，取出后利用粉碎機將核桃殼粉碎至10 mm左右的塊狀，核桃殼碎屑棄用，將剩余的核桃殼塊按要求粒徑過篩并存于自封袋內備用。

1.3.2 培養(yǎng)基的制備

LB富集培養(yǎng)基：分別稱取5 g蛋白胨、2.5 g酵母浸粉、5 g氯化鈉溶于500 mL蒸餾水中，調節(jié)pH為7.0 ± 0.2，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min，冷卻后用于細菌富集。

無機鹽培養(yǎng)基：分別稱取Na2HPO44.26 g、KH2PO42.65 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl20.02 g、NH4Cl 0.1 g，1 mL的微量元素[11]投加至1000 mL蒸餾水中，調節(jié)pH至7.0 ± 0.2，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min，冷卻后用于細菌培養(yǎng)。

1.3.3 核桃殼載體吸附苯酚實驗

配制所需濃度的苯酚溶液，稱取0.1～0.9 g核桃殼分別投加到苯酚溶液中，搖床溫度為37 ℃，轉速為160 r/min進行吸附實驗，5 h內取樣測定苯酚濃度。

1.3.4 固定化微生物的制備

1.重新構建了會計核算模式。政府新會計制度構建了“財務會計和預算會計適度分離并相互銜接”的會計核算模式。分離了財務會計和預算會計功能、財務報告和決算報告功能，讓政府會計主體的財務信息和預算執(zhí)行信息得到更加全面的反饋。主要體現在“雙功能、雙基礎、雙報告”上。“雙功能”是指按照政府新會計制度改革以后，事業(yè)單位會計核算同時具有權責發(fā)生制和收付實現制的兩大功能；“雙基礎”是指財務會計按資產、負債、凈資產、收入與費用五大會計要素進行核算，而預算會計按預算收入、預算支出與預算結余三大會計要素進行核算；“雙報告”是指財務會計編制的財務報告和預算會計編制的決算報告。

分別稱取一定質量預處理好的核桃殼投加至LB培養(yǎng)基中，滅菌冷卻后，將無色桿菌LQ-1接種到LB培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)30 h左右(搖床溫度為37 ℃，轉速為160 r/min)[12]，LB培養(yǎng)基明顯變得渾濁，核桃殼載體上形成吸附固定化生物膜，用鑷子取出，用蒸餾水輕輕沖洗2～3次，去除核桃殼表面的游離細胞，得到核桃殼固定化微生物。

固定化微生物的細菌負載量測定如下：利用超聲波清洗器將負載到材料上的無色桿菌震蕩至無機鹽培養(yǎng)基中，測定OD600進行換算，得到菌體的負載量。

1.3.5 固定化微生物降解苯酚實驗

250 mL的錐形瓶中加入滅菌的無機鹽溶液100 mL，配制好濃度約為300 mg/L的苯酚溶液。初始的游離菌濃度OD600為0.2～0.3，固定化微生物按固定質量投加，苯酚濃度變化實驗，固定化微生物投加量為0.5 g，苯酚濃度范圍為100～800 mg/L，恒溫搖床培養(yǎng)，每間隔2 h取樣測定苯酚濃度。

1.3.6 固定化微生物降解苯酚重復性實驗

當苯酚溶液吸光度快接近于零時，取出其中的核桃殼固定化微生物，輕輕沖洗表面的游離細菌，再放至重新配制好的300 mg/L的苯酚的溶液中，重復下次實驗，每隔一定時間取樣測定溶液的OD600和苯酚濃度。

1.4 數據分析方法

1.4.1 苯酚濃度的測定

1.4.2 細菌質量濃度的測定

在600 nm下，采用紫外分光光度計測量出菌密度數值的大小OD600，并用稱重法測定對應OD600與質量濃度的換算關系，計算出細菌的質量[14]。細菌吸光度值OD600與細菌質量濃度的關系式：

y=0.3108x+0.0033

式中：y為細菌的質量濃度(mg/mL或g/L)；x為細菌吸光度值即OD600

2 結果與討論

2.1 游離菌降解苯酚性能

無色桿菌LQ-1降解苯酚的能力如圖2所示，反應體系初始OD600為0.246，細胞濃度為0.080 mg/mL。在0～15 h細菌降解苯酚速率較緩慢，苯酚濃度從309.92 mg/L降至205.86 mg/L，去除率為33.57%。15 h后細菌降解苯酚速率增加，20 h 后苯酚濃度降至33.04 mg/L，去除率為89.34%，在28 h時達到98%以上。同時，隨著時間的增加，開始時苯酚有抑制作用，菌量降低，9 h后，微生物適應了苯酚環(huán)境，利用苯酚作為底物，自身不斷生長增殖，細菌濃度逐漸增加，在25 h達到飽和狀態(tài)，細胞濃度達到0.192 mg/mL。

圖2 無色桿菌LQ-1降解苯酚曲線

2.2 固定化載體對細菌的負載能力研究

取不同粒徑的核桃殼各0.5 g，考察不同粒徑核桃殼對細菌負載量的影響，如圖3所示，核桃殼粒徑越小，細菌負載的效果越好，0.5 g核桃殼(1～2 mm)的細菌負載量為2.173 mg，同樣質量下3～5 mm核桃殼的細菌負載量為1.632 mg。雖然1～2 mm的核桃殼比表面積最大，效果最好，但由于其粒徑較小，易流失，因此后續(xù)實驗選擇粒徑為3～5 mm的核桃殼作為細菌吸附載體。

圖3 不同粒徑核桃殼載體對菌的負載效果

粒徑為3～5 mm的核桃殼投加量對細菌負載量的影響如圖4所示，核桃殼投加量為0.1 g時，細菌負載量為0.453 mg，當核桃殼投加量增長至0.9 g時，細菌負載量為2.671 mg，增長了近6倍。細菌負載量隨核桃殼載體投加量的增加而增加，相關系數接近于1，線性關系良好，負載能力穩(wěn)定。

圖4 不同投加量核桃殼載體對菌的負載效果

固定化微生物技術可降低功能微生物受外界不利因素的影響程度，微生物活性強、密度高。

吸附法主要利用材料孔隙、表面官能團、靜電作用力等實現微生物固定[15]，不同性質載體表面差異會造成胞外聚合物(EPS)等微生物分泌物性質上的差異，從而導致附著和負載情況不同[16]。核桃殼作為植物載體，有天然環(huán)保的優(yōu)點，成本低，直接用來作為微生物固定化載體，不會帶來二次污染，負載細菌能力穩(wěn)定，同時達到了以廢治廢的目的[17]。

2.3 核桃殼載體吸附苯酚能力研究

不同投加量核桃殼對苯酚的吸附曲線如圖5A所示，由圖可知，在苯酚濃度為300 mg/L的情況下，隨著核桃殼投加量的增多，苯酚吸附量發(fā)生變化，5 h基本達到吸附飽和，平衡吸附量隨著核桃殼質量的增多而減小，投加0.1、0.5和0.9 g核桃殼時苯酚的平衡吸附量分別為19.936、8.134、4.563 mg/g，說明投加更高濃度的核桃殼并不能實際增大其吸附苯酚的能力，按照去除率統計投加0.7 g核桃殼時苯酚去除率最大為13.84%。不同苯酚濃度的吸附曲線如圖5B所示，小于100 mg/L的苯酚5 h后的去除率可以達到85%以上，隨著本底濃度的增高，平衡吸附量相對穩(wěn)定在16 mg/g以下，去除率有所降低，300 mg/L的苯酚溶液，投加0.5 g的核桃殼，平衡吸附量為8.916 mg/g，去除率為13.99%。實驗結果表明，核桃殼具有一定的吸附能力，但效果一般，天然核桃殼本身空隙結構不規(guī)則，其表面電荷性質與苯酚產生吸附的匹配度較低[18]。

圖5 核桃殼投加量(A)及苯酚起始濃度(B)對吸附效果的影響

2.4 固定化微生物苯酚降解性能研究

游離菌及固定化細菌降解苯酚過程如圖6所示，游離細菌的投加量控制OD600為0.2～0.3，實際菌濃度約為0.080 mg/mL，8 h后開始有效降解苯酚，25 h左右降解完全。對于固定化微生物，其降解苯酚能力顯著提高，整體而言，在12 h之前，核桃殼固定化微生物降解苯酚較緩慢，與游離微生物修復效果差異不大，這是因為微生物在初期主要是在合成自身物質，處于生長階段，苯酚濃度的降低主要由吸附所致，12 h后速度明顯提高，0.5 g的固定化細菌，20 h的去除率即可達到98.40%，對于0.9 g的固定化細菌，16 h去除率即可達到95.47%。在此過程中，核桃殼吸附及微生物降解具有協同作用，此外，天然核桃殼本身分解產物可能為苯酚降解微生物提供了共代謝底物，促進了菌量的增加，強化了苯酚處理效果。

圖6 游離菌與固定化微生物降解苯酚曲線

考察固定化微生物對不同濃度苯酚降解效果，如圖7所示，投加0.5 g的固定化菌，隨著苯酚底物濃度的增大，苯酚降解時間延長，最終可以耐受700 mg/L的苯酚濃度，36、40 h去除率分別達到94.63%和97.83%，但當苯酚濃度提升到800 mg/L時，濃度過高可能對固化微生物產生毒害作用，使得生物降解停滯。

圖7 固定化微生物降解苯酚不同濃度苯酚曲線

實驗中對游離細胞進行了降解苯酚濃度適應性研究，游離細胞能耐受的苯酚濃度為500 mg/L，固定化細菌明顯提高，這是因為固定化細菌與載體的多位點結合使其內部結構更加穩(wěn)定，降低了苯酚毒性對細菌分子結構及酶系的影響和破壞[19-20]。王蕾等[21]利用PUF固定化菌株降解苯酚，經過120 h 對1 000 mg /L 苯酚的降解率達到72.96%，雖然其可以耐受更高濃度的苯酚，但反應周期過長，降解率也偏低。

2.5 核桃殼固定化微生物的重復利用性研究

核桃殼固定化微生物的重復利用性研究如圖8所示，在第1次使用時，23 h的苯酚降解率達99.33%。重復使用6次，苯酚去除率保持99%以上，降解時間大大降低，去除300 mg/L的苯酚由原來的23 h縮短至14 h，此過程細菌會在核桃殼表面形成一層生物膜，對外部的適應性逐漸增強，初始的負載菌量也隨之增加，降解苯酚效率提高。重復使用7次后苯酚的去除率開始逐漸降低，菌量也隨之降低，其主要原因是多次的重復使用導致核桃殼表面的附著菌體能力降低，傳質阻力提高，生物膜脫落，菌體流失及老化[22]。

圖8 核桃殼固定化微生物的重復利用

3 結論

(1)無色桿菌LQ-1降解苯酚，反應體系初始細胞濃度為0.080 mg/mL ，28 h去除率達到98%以上，細胞濃度增長至0.192 mg/mL。

(2)粒徑為3～5 mm的核桃殼作為細菌吸附載體性能穩(wěn)定，0.5 g核桃殼的細菌負載量為1.632 mg；核桃殼具有一定的苯酚吸附能力，但效果一般，300 mg/L的苯酚溶液，投加0.5 g的核桃殼，平衡吸附量為8.916 mg/g，去除率為13.99%。

(3)固定化微生物降解苯酚能力顯著提高，投加0.5 g的固定化細胞，20 h的去除率即可達到98.40%，核桃殼吸附及微生物降解協同作用強化了苯酚處理效果。

(4)固定化細菌可耐受700 mg/L的苯酚濃度，優(yōu)于游離細菌，40 h去除率達到97.83%。核桃殼固定化微生物重復使用6次，苯酚去除率保持99%以上，去除300 mg/L的苯酚由原來的23 h縮短至14 h。