李涵，邵長樂，王亞超，邵水金，國海東

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，上海 201203

心血管疾病是當(dāng)今世界人類死亡的最主要原因，尤其是心肌梗死（myocardial infarction，MI）病死率呈快速上升趨勢[1]。MI 發(fā)生后，死亡的心肌細(xì)胞被成纖維細(xì)胞所代替，引起心室重構(gòu)和瘢痕形成，最終可能導(dǎo)致心力衰竭，甚至死亡。近20 年，通過干細(xì)胞移植修復(fù)壞死心肌為治療MI 帶來新的希望[2]，但由于心肌局部組織缺血缺氧，嚴(yán)重影響干細(xì)胞移植后的存活和分化效率[3]，尤其是干細(xì)胞只有分化為心肌細(xì)胞后，才能發(fā)揮替代壞死心肌細(xì)胞的作用，從而達(dá)到治療MI 的目的。干細(xì)胞移植后向功能性心肌細(xì)胞定向分化需要精細(xì)的調(diào)控和合適的誘導(dǎo)環(huán)境[4]。

誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的手段主要包括擬胚體生成法、細(xì)胞共培養(yǎng)、生長因子等方法[5]。這些誘導(dǎo)方法需要進(jìn)一步優(yōu)化以提高誘導(dǎo)效率及誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞的功能。中藥可能含有誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的有效成分。已有諸多關(guān)于中藥有效成分誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的研究報道[6]。三七是臨床治療心血管疾病的常用中藥，含有多種三七皂苷和人參皂苷，其是否對干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化具有一定的誘導(dǎo)作用值得研究。然而，目前有關(guān)中藥誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化的研究比較單一，缺乏有效的篩選措施，不能系統(tǒng)地比較各種有效成分的誘導(dǎo)效率。

由Myh6 編碼的α-肌球蛋白重鏈（α-myosin heavy chain，α-MHC）是心肌特有的蛋白[7]。雖然心肌肌球蛋白輕鏈2V（myosin light chain 2V，MLC2V）和心肌肌鈣蛋白T（cTnT）啟動子也能作為向心肌分化的標(biāo)記，但Myh6 啟動子向心肌分化的特異性高于MLC2V 和cTnT 啟動子，因此，用Myh6 示蹤干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的特異性比MLC2V 和cTnT 高[8]。本研究將Myh6 基因的啟動子區(qū)域克隆并插入pGL6報告質(zhì)粒熒光素酶基因的上游，構(gòu)建心肌細(xì)胞特異啟動子熒光素酶報告基因系統(tǒng)（Myh6-Luc），以高效靈敏地篩選向心肌細(xì)胞分化的中藥誘導(dǎo)劑。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物

三七素（批號19103029）、三七皂苷Fa（批號19050623）、三七皂苷Fe（批號19102821）、三七皂苷R1（Notoginsenoside R1，NGR1，批號19071624）、人參皂苷Rb1（批號19030522）、人參皂苷Rb2（批號19090421）及人參皂苷Rh1（批號19011421），上海同田生物技術(shù)公司，純度≥98%。

1.2 細(xì)胞

小鼠畸胎瘤細(xì)胞P19，賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 主要試劑與儀器

無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（貨號DP117）、miRcute miRNA 提取分離試劑盒（貨號DP501）、miRcute 增強(qiáng)型miRNA 熒光定量檢測試劑盒（貨號FP411），天根生化科技有限公司；DH5α 感受態(tài)（貨號D0351）、pGL6 質(zhì)粒（貨號D2102），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ（貨號R3142S）、BglⅡ（貨號R0144S），美國New England Biolabs；PCR 試劑盒（貨號B639293），生工生物工程（上海）股份有限公司；MEM-α 培養(yǎng)基（貨號iCell-0003），賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；0.25%胰蛋白酶（貨號25-053-CIa）、PBS（貨號21-040-CV）、雙抗（貨號30-002-CIa），美國Corning；澳洲胎牛血清（貨號10099141C）、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（貨號11668-027），美國Thermo Fisher Scientific；二甲基亞砜（DMSO，貨號D2650-5X10ML），美國Sigma-Aldrich；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號E1910），美國Promega 公司；cTnT 抗體（貨號15513-1-AP），美國Proteintech 公司；熒光二抗（貨號4412S），美國CST 公司；VECTASHIELD 抗熒光淬滅封片劑（貨號H-1200），美國Vector Labs 公司。全自動凝膠成像系統(tǒng)（2500R，上海天能），電泳儀（EPS300，上海天能），電熱恒溫水浴鍋（HWS-24，上海一恒），多功能酶標(biāo)儀（Synergy HT，美國BioTek 公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（371，美國Thermo Fisher Scientific），倒置熒光顯微鏡（IX51，日本Olympus 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Myh6-Luc 重組質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)pGL6 上的酶切位點(diǎn)和Myh6啟動子序列（～1 507 bp），選擇KpnⅠ和BglⅡ雙酶切，將酶切位點(diǎn)引入PCR 產(chǎn)物中。用P19 細(xì)胞基因組作為模板，通過PCR 調(diào)取Myh6 啟動子序列。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行跑膠回收，37 ℃水浴鍋進(jìn)行KpnⅠ和BglⅡ雙酶切反應(yīng)。同時對pGL6 進(jìn)行KpnⅠ和BglⅡ雙酶切。將酶切后pGL6 載體和酶切后Myh6 通過T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接。取上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)，涂板過夜培養(yǎng)。篩選陽性克隆用雙酶切進(jìn)行鑒定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基因測序。

2.2 P19 細(xì)胞培養(yǎng)

將P19 細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用含10%胎牛血清和1%雙抗的MEM-α 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%～90%進(jìn)行細(xì)胞傳代。將細(xì)胞接種至24 孔板，設(shè)置不同分組，培養(yǎng)24 h。

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

細(xì)胞接種后培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h 更換不含血清的培養(yǎng)液，隨后將質(zhì)粒pRL-SV40 和Myh6-Luc 按1∶15比例通過轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例為2∶1，轉(zhuǎn)染混合物與培養(yǎng)基的比例為1∶10。轉(zhuǎn)染6～8 h 后吸棄培養(yǎng)基，換成新的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染第2 日使用誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)7 d，期間每日更換含誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基。

2.4 雙熒光素酶檢測

誘導(dǎo)結(jié)束后吸去細(xì)胞上清液，PBS 漂洗細(xì)胞，加入1×PLB 裂解液，室溫輕輕晃動培養(yǎng)板15 min 進(jìn)行裂解，裂解結(jié)束后將液體吸出，12 000 r/min 離心5 min，吸取上清液，置于黑色圓底96 孔板，每孔加入20 μL上清液。設(shè)置自動進(jìn)樣器1 和2 分別為LARⅡ和Stop&Glo?試劑，每孔加入100 μL LARⅡ檢測螢火蟲熒光素酶活性，然后加入100 μL Stop&Glo?試劑檢測海腎熒光素酶活性，檢測時設(shè)置1～2 s 延遲和5～10 s 讀數(shù)，之后對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.5 免疫熒光染色

誘導(dǎo)結(jié)束后，吸去細(xì)胞上清液，PBS 清洗2 次，4%多聚甲醛固定30 min；滴加0.5% Triton X-100，室溫處理10 min 破膜，增加細(xì)胞膜通透性；PBS 洗3次；山羊血清37 ℃封閉30 min，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；滴加cTnT 一抗（1∶50）于4 ℃下孵育過夜；PBS 洗3 次，滴加熒光二抗（1∶500），37 ℃孵育1 h；PBS 洗3 次，每次10 min。抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并進(jìn)行拍照。

2.6 RT-qPCR 檢測

誘導(dǎo)結(jié)束后，通過miRcute miRNA 提取分離試劑盒提取細(xì)胞miRNA，每組各取1 μg miRNA，采用miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將miRcute 增強(qiáng)型miRNA 熒光定量檢測試劑盒中 2×miRcute Plus miRNA Premix、Reverse Primer 和50×ROX Reference Dye 在冰上融化，配制反應(yīng)體系后進(jìn)行qPCR 檢測。反應(yīng)條件：95 ℃變性15 min；94 ℃、20 s，60 ℃、34 s，45 個循環(huán)。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

以螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值比值計算相對熒光素酶活性。采用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析（LSD-t）。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 Myh6-Luc 構(gòu)建與鑒定

瓊脂糖凝膠電泳成像顯示，KpnⅠ/BglⅡ雙酶切后出現(xiàn)1 507 bp 和5.5 k 兩條特異性條帶，條帶大小與理論值相吻合，見圖1。經(jīng)基因測序后發(fā)現(xiàn)，插入的基因序列與Myh6 啟動子序列完全一致。表明心肌細(xì)胞特異啟動子Myh6-Luc 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，可用于后續(xù)篩選實(shí)驗(yàn)。

圖1 Myh6-Luc 報告質(zhì)粒的構(gòu)建與酶切鑒定

4.2 熒光素酶報告基因體系驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)分為對照組（包括未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染）和陽性誘導(dǎo)劑DMSO 組（包括未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染）。DMSO 濃度為0.005%，誘導(dǎo)7 d 后進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測。結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染的對照組和DMSO 組相對熒光素酶活性較低。與對照組（轉(zhuǎn)染）比較，DMSO 組（轉(zhuǎn)染）相對熒光素酶活性顯著提高，表明熒光素酶報告基因體系建立成功，見圖2。

4.3 中藥單體篩選

利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)對三七素、三七皂苷Fa、三七皂苷Fe、NGR1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2 及人參皂苷Rh1 共7 種中藥單體進(jìn)行篩選。每種藥物設(shè)置0.01、0.1、1、10 μmol/L 4 個濃度，對照組不加任何誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)7 d 后進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測。結(jié)果顯示，與對照組比較，0.1 μmol/L 三七皂苷Fe、1 μmol/L NGR1 和10 μmol/L 人參皂苷Rh1 組相對熒光素酶活性顯著升高，其中1 μmol/L NGR1 誘導(dǎo)效果最明顯。低濃度三七素（0.01、0.1、1 μmol/L）、高濃度三七皂苷Fe（1、10 μmol/L）及中濃度人參皂苷Rb2（0.1、1 μmol/L）能顯著抑制相對熒光素酶活性，見圖3。

圖3 不同濃度三七素、三七皂苷Fa、三七皂苷Fe、NGR1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2 和人參皂苷Rh1 對Myh6 啟動子活性的影響（，n＝6）

4.4 1 μmol/L NGR1 誘導(dǎo)效果驗(yàn)證

通過免疫熒光染色驗(yàn)證1 μmol/L NGR1 誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化效果，實(shí)驗(yàn)分為P19 組和P19＋NGR1 組。結(jié)果顯示，1 μmol/L NGR1 誘導(dǎo)7 d 后，大部分P19 細(xì)胞表達(dá)cTnT，表明1 μmol/L NGR1 能成功誘導(dǎo)P19 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，見圖4。

圖4 NGR1 誘導(dǎo)后P19 細(xì)胞cTnT 陽性表達(dá)（免疫熒光染色，Bar＝100 μm）

4.5 1 μmol/L NGR1 對P19 細(xì)胞miR-1 和miR-25 表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探討1 μmol/L NGR1 誘導(dǎo)P19 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的作用機(jī)制，通過RT-qPCR 檢測誘導(dǎo)7 d后miR-1 和miR-25 mRNA 表達(dá)，實(shí)驗(yàn)分為P19 組和P19＋NGR1 組。結(jié)果顯示，與P19 組比較，1 μmol/L NGR1 誘導(dǎo)后miR-1 表達(dá)顯著升高，miR-25 表達(dá)顯著降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 NGR1 對P19 細(xì)胞miR-1 和miR-25 表達(dá)的影響（，n＝6）

5 討論

雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)是以熒光素為底物檢測螢火蟲熒光素酶活性的一種報告系統(tǒng)。可以通過化學(xué)發(fā)光儀檢測氧化過程中釋放的生物熒光，從而靈敏、高效地檢測基因的表達(dá)，是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA 相互作用的一種方法。螢火蟲熒光素和海腎熒光素是常用的報告基因，通過氧化不同底物產(chǎn)生可定量的熒光[9]。Koley 等[10]采用心鈉素（atrial natriuretic factor，ANF）啟動子熒光素酶報告系統(tǒng)對小分子化合物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)VUT-MK142 可促進(jìn)心臟前中胚層向心肌細(xì)胞分化。ANF 是一種主要在心肌細(xì)胞中合成的多肽激素。本研究中，我們將Myh6 基因的啟動子區(qū)域克隆并插入pGL6 報告質(zhì)粒熒光素酶基因的上游，得到報告質(zhì)粒Myh6-Luc，構(gòu)建心肌細(xì)胞特異啟動子熒光素酶報告基因系統(tǒng)。瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)、基因測序和雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，報告基因質(zhì)粒Myh6-Luc 構(gòu)建成功。

通過該篩選系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，藥物濃度對誘導(dǎo)P19 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化具有較大的影響。如10 μmol/L 三七素對P19 細(xì)胞分化無影響，0.01、0.1、1 μmol/L 三七素卻顯著抑制熒光素酶活性；0.1 μmol/L 三七皂苷Fe可促進(jìn)P19 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，而1、10 μmol/L 三七皂苷Fe 可抑制P19 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化；1 μmol/L NGR1 誘導(dǎo)效果十分明顯。李晨琳等[11]發(fā)現(xiàn)，中濃度牡蠣蛋白肽對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）誘導(dǎo)分化作用最強(qiáng)，且顯著高于高濃度的誘導(dǎo)作用。低濃度骨碎補(bǔ)總黃酮能促進(jìn)大鼠BMSCs 向成骨細(xì)胞分化[12]。也有研究發(fā)現(xiàn)，中濃度5-氮胞苷是誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化的最適濃度[13]。因此，在中藥單體篩選中應(yīng)重視藥物不同濃度的影響。此外，本研究只檢測了7 種中藥單體的誘導(dǎo)作用，在今后的研究中，可利用該系統(tǒng)對更多的中藥單體成分進(jìn)行檢測，尤其臨床治療心血管疾病的常用中藥單體，從而篩選出更為有效的中藥誘導(dǎo)劑。

NGR1 是中藥三七的主要活性成分，其能保護(hù)H9C2 心肌細(xì)胞對抗缺氧損傷[14]，提高H9C2 細(xì)胞的存活率，維持肌動蛋白骨架和線粒體形態(tài)，減少氧糖剝奪后復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15]，對心肌細(xì)胞有直接的抗炎、抗凋亡作用[16]。還有研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷能促進(jìn)BMSCs 體外增殖和向心肌樣細(xì)胞分化[17]。P19細(xì)胞是體外細(xì)胞誘導(dǎo)分化最常用的細(xì)胞系，雖然本研究發(fā)現(xiàn)1 μmol/L NGR1可激活P19細(xì)胞Myh6啟動子，并通過免疫熒光染色進(jìn)行驗(yàn)證，但仍應(yīng)在胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞上進(jìn)一步驗(yàn)證，并在此基礎(chǔ)上開展動物實(shí)驗(yàn)，為臨床應(yīng)用NGR1 治療缺血性心肌病提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，除用DMSO 作為陽性誘導(dǎo)劑外，10 nmol/L 全反式維甲酸也可促進(jìn)ESC 向心肌細(xì)胞分化[18]。

在干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的過程中多種miRNA表達(dá)發(fā)生變化。miR-1 在調(diào)控心肌祖細(xì)胞分化中起著重要作用，可促進(jìn)移植ESC 向心肌細(xì)胞分化，并抑制MI 后細(xì)胞凋亡[19]。miR-1 和miR-133 可能在小鼠ESC 心肌細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用，并且Cdk9可能作為miR-1 的靶點(diǎn)參與這一過程[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-25 能明顯抑制P19 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，其作用機(jī)制可能與調(diào)控Notch 信號通路有關(guān)[21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L NGR1 誘導(dǎo)后可顯著提高miR-1 的表達(dá)，同時抑制miR-25 的表達(dá)。因此，NGR1 誘導(dǎo)P19 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的機(jī)制可能與上調(diào)miR-1 和下調(diào)miR-25 的表達(dá)有關(guān)，其具體作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。

綜上，本研究成功構(gòu)建雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)Myh6-Luc，通過該系統(tǒng)可有效篩選向心肌細(xì)胞分化的中藥有效成分，并且發(fā)現(xiàn)1 μmol/L NGR1 能成功誘導(dǎo)P19 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，其作用機(jī)制與上調(diào)miR-1表達(dá)、下調(diào)miR-25 表達(dá)有關(guān)。本研究為誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化提供了新的手段和工具，也為優(yōu)化干細(xì)胞移植治療MI 等心血管疾病提供了參考和依據(jù)。