張靜 李玉靜 張二敬 李紫然 劉靜靜 李春生

摘 要：為制備豬骨骼肌肌鈣蛋白T單克隆抗體，利用生物化學(xué)方法提取豬骨骼肌肌鈣蛋白并免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合制備穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，采取體內(nèi)誘生腹水法批量制備單克隆抗體，并對(duì)其免疫學(xué)特征進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：最終篩選獲得1 株雜交瘤細(xì)胞株，將其命名為2E8，其分泌的抗體為免疫球蛋白G 2a亞型，效價(jià)為1∶4.1×105，親和力常數(shù)為5.14×106 L/mol;采用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)單克隆抗體2E8特異性，結(jié)果表明，單克隆抗體2E8與雞、鴨檢測(cè)原的交叉反應(yīng)率均為25%;與牛、羊檢測(cè)原的交叉反應(yīng)率分別為1.7%、6.3%;免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，單克隆抗體2E8與豬檢測(cè)原反應(yīng)條帶清晰，與羊、雞、鴨檢測(cè)原反應(yīng)條帶輕微，與牛檢測(cè)原幾乎不發(fā)生反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：豬骨骼肌肌鈣蛋白T;單克隆抗體;肉類(lèi)摻假;間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定;免疫學(xué)特征

Preparation and Characterization of Monoclonal Antibody against Porcine Skeletal Muscle Troponin T

ZHANG Jing1， LI Yujing2， ZHANG Erjing3， LI Ziran3， LIU Jingjing1， LI Chunsheng1，*

（1. Institute of Biology， Hebei Academy of Science， Shijiazhuang 050081， China; 2. Hebei Jiaotong Vocational and Technical College， Shijiazhuang 050035， China; 3. College of Life Sciences， Hebei Normal University， Shijiazhuang 050024， China）

Abstract： In order to prepare monoclonal antibodies against porcine skeletal muscle troponin T （sTnT）， porcine skeletal muscle troponins were extracted by biochemical methods and used to immunize mice. By means of cell fusion， we acquired hybridoma cell strains that can secrete monoclonal antibodies （mAbs） stably. Ascites was induced in vivo to further prepare and characterize monoclonal antibodies against sTnT. Finally， we screened out one hybridoma cell strain that secretes mAb stably and named it 2E8. The monoclonal antibody 2E8 belonged to the IgG2a subtype， whose titer and affinity constant were 1 ： 4.1 × 105 and 5.14 × 106 L/mol， respectively. The specificity of 2E8 was evaluated by indirect enzyme-linked immunosorbent assay （iELISA）. The cross-reactivity with chicken sTnT and duck sTnT were both 25%. The cross-reactivity with bovine sTnT and goat sTnT were 1.7% and 6.3% respectively. Immunoblotting data showed that the monoclonal antibody 2E8 exhibited a clear band after reaction with the porcine antigen， but only a slight band after reaction with the goat， chicken， or duck antigen. In addition， the monoclonal antibody hardly reacted with the bovine antigen.

Keywords： porcine skeletal muscle troponin T; monoclonal antibody; meat adulteration; indirect enzyme-linked immunosorbent assay; immunological characteristics

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210417-102

中圖分類(lèi)號(hào)：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2021）09-0033-05

引文格式：

張靜， 李玉靜， 張二敬， 等. 豬骨骼肌肌鈣蛋白T單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 肉類(lèi)研究， 2021， 35（9）： 33-37. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210417-102.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHANG Jing， LI Yujing， ZHANG Erjing， et al. Preparation and characterization of monoclonal antibody against porcine skeletal muscle troponin T[J]. Meat Research， 2021， 35（9）： 33-37. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210417-102.

http：//www.rlyj.net.cn

肉類(lèi)及其制品是百姓餐桌上不可或缺的美味，市場(chǎng)對(duì)肉類(lèi)的需求逐年增加，肉類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題隨之成為重要的民生問(wèn)題，在利益驅(qū)使下，肉類(lèi)及其制品摻假問(wèn)題頻繁發(fā)生。例如，豬肉、雞肉或鴨肉部分代替牛肉或羊肉[1-2]、馬肉充當(dāng)牛肉[3]、馬肉冒充驢肉[4]等。目前，對(duì)肉類(lèi)及其制品摻假檢測(cè)技術(shù)主要有感官鑒別[5]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[6-12]、紅外光譜[13-17]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[18-22]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[23-27]等方法。ELISA方法基于抗原與抗體的特異性結(jié)合，從而捕獲目的蛋白，具有高敏感性、特異性的特點(diǎn)，且方法簡(jiǎn)便，不需要昂貴的儀器設(shè)備[28]。

肉制品加工過(guò)程中常采用的蒸煮、烘烤等處理會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解或損失[28]。對(duì)耐熱性標(biāo)志蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，肌鈣蛋白具有熱穩(wěn)定性，可以作為生肉及熱加工肉制品的肉源性成分鑒別標(biāo)志蛋白[29-30]。骨骼肌肌鈣蛋白是調(diào)節(jié)橫紋肌收縮功能的結(jié)構(gòu)蛋白，包括sTn T、sTn C和sTn I 3 個(gè)亞基，其分子質(zhì)量分別為37、18、24 kDa[31-34]。

本研究采用2 種蛋白質(zhì)提取方法[28-29]，對(duì)豬骨骼肌肌肉組織進(jìn)行研磨、煮沸、勻質(zhì)等操作，獲得豬骨骼肌肌鈣蛋白免疫原及檢測(cè)原。通過(guò)免疫小鼠制備單克隆抗體，并對(duì)抗體的效價(jià)、特異性等特征進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究對(duì)建立豬肉源性成分免疫學(xué)鑒別方法，進(jìn)一步促進(jìn)肉類(lèi)制品摻雜、摻假的快速檢測(cè)研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、細(xì)胞培養(yǎng)板 美國(guó)康寧公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 美國(guó)Gibco公司;HAT培養(yǎng)基補(bǔ)充劑（50×）Hybri-MaxTM、HT培養(yǎng)基補(bǔ)充劑（50×）Hybri-MaxTM、免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig）亞型檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Sigma公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 北京中杉金橋生物科技有限公司;丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tris、四甲基乙二胺（N，N，N，N-tetramethylethylenediamine，TEMED） 美國(guó)BBI公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

BALB/c小鼠由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（冀）2018-004。

1.2 儀器與設(shè)備

MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司;SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;CKX41SF倒置顯微鏡 日本Olympus公司;4710超聲破碎儀

美國(guó)Cole-Parmer儀器公司;Heraus Multifuge高速冷凍離心機(jī)、ND2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀、MT-13K-L迷你手持均質(zhì)儀 杭州米歐儀器有限公司、Multiskan Go 1510型酶標(biāo)儀 德國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 豬骨骼肌肌鈣蛋白免疫原的提取及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）鑒定

取新鮮豬腿肉10 g，去除脂肪及結(jié)締組織，剁碎，加入20 mL 0.15 mol/L NaCl溶液，用勻質(zhì)儀勻質(zhì)1 h。超聲波（100 W、5 min）處理后沸水浴20 min，6 000 r/min離心30 min，取上清液，121 ℃、0.12 MPa處理30 min。用Whatman No.1濾紙過(guò)濾，向?yàn)V液中按體積比1∶3.74加入體積分?jǐn)?shù)90%乙醇，8 000 r/min離心20 min，棄上清，將沉淀溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中，得到豬骨骼肌肌鈣蛋白免疫原，用超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定溶液蛋白質(zhì)量濃度，于-20 ℃或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

配制12%分離膠、5%濃縮膠，對(duì)豬骨骼肌肌鈣蛋白免疫原進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3.2 檢測(cè)原的提取及SDS-PAGE鑒定

取新鮮豬、牛、羊、雞、鴨腿肉若干，切塊、分裝，于-80 ℃保存，使用前于室溫放置3 h完全解凍。分別稱(chēng)取各種肉樣10 g，剁碎，分別裝于離心管中，沸水浴15 min后，立即用冰水冷卻，向離心管中加入20 mL含0.5 mol/L NaCl的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，勻質(zhì)1 h。6 000 r/min離心30 min，棄沉淀，取上清，得到以上各物種骨骼肌提取物，即為相應(yīng)骨骼肌肌鈣蛋白檢測(cè)原，用超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定溶液蛋白質(zhì)量濃度，于-20 ℃或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

配制12%分離膠、5%濃縮膠，對(duì)檢測(cè)原進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.3.3 動(dòng)物免疫

用生理鹽水將豬骨骼肌肌鈣蛋白免疫原稀釋至0.2 mg/mL，取600 μL稀釋的免疫原溶液與等體積弗氏佐劑混合振蕩10 min，首次免疫選用弗氏完全佐劑，之后免疫選用弗氏不完全佐劑。取BALB/c小鼠3 只，向其頸背部注射上述含弗氏佐劑的豬骨骼肌肌鈣蛋白免疫原，注射劑量400 μL/只，共免疫4 次，每隔2 周免疫1 次，最后一次免疫10 d后斷尾取血，間接ELISA方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)，選取效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 豬骨骼肌肌鈣蛋白單克隆抗體的制備

參考文獻(xiàn)[27]的方法，采用PEG法進(jìn)行細(xì)胞融合，融合7 d后出現(xiàn)細(xì)胞集落，更換HT培養(yǎng)基。用間接ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清，篩選分泌單克隆抗體為陽(yáng)性的孔，通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞亞克隆，得到抗體分泌穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株。取1 只BALB/c小鼠進(jìn)行致敏，向其腹腔內(nèi)注射500 μL石蠟油，致敏14 d后，向其腹腔注射入雜交瘤細(xì)胞，12 d后待腹部膨大取腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化，得到單克隆抗體，檢測(cè)抗體質(zhì)量濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 豬骨骼肌肌鈣蛋白單克隆抗體特征評(píng)價(jià)

1.3.5.1 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA方法進(jìn)行單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定[27]。

用含0.015 mol/L Na2CO3、0.035 mol/L NaHCO3的碳酸鹽緩沖液將檢測(cè)原質(zhì)量濃度稀釋至2 μg/mL，加入96 孔板，每孔100 μL，37 ℃包被1 h;用含0.1%吐溫-20的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌，每孔洗滌3次，拍干;用含0.1%吐溫-20的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液將單克隆抗體以1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800、1∶409 600、1∶819 200做倍比稀釋?zhuān)靠准尤?00 μL，37 ℃孵育45 min，洗滌，拍干;每孔加入100 μL山羊抗小鼠IgG二抗（稀釋比例1∶10 000），37 ℃孵育30 min，洗滌，拍干;每孔加入100 μL顯色液，37 ℃避光反應(yīng)12 min;每孔加入50 μL終止液，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（optical density，OD）值。陰性對(duì)照孔（0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液）記為OD0，各實(shí)驗(yàn)孔記為ODt，以O(shè)Dt/OD0≥2.1所對(duì)應(yīng)的稀釋比作為效價(jià)檢測(cè)結(jié)果。

1.3.5.2 單克隆抗體亞型測(cè)定

按照Ig亞型檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5.3 單克隆抗體特異性測(cè)定

用間接ELISA方法測(cè)定單克隆抗體與牛、羊、雞、鴨骨骼肌提取物的效價(jià)[27]。

用免疫印跡方法檢測(cè)單克隆抗體與豬、牛、羊、雞、鴨骨骼肌提取物結(jié)合的特異性。取1.3.2節(jié)制備的豬、牛、羊、雞、鴨檢測(cè)原各15 μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，切膠，92 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜1 h，封閉，洗膜，用封閉液（含5 g/100 mL牛血清白蛋白、0.05%吐溫-20、0.8 g/100 mL NaCl、0.01 mol/L的Tris緩沖液）將單克隆抗體溶液按體積比1∶2 000稀釋?zhuān)?7 ℃搖動(dòng)孵育1～1.5 h，洗膜，再用上述封閉液將山羊抗小鼠IgG二抗按1∶3 000稀釋?zhuān)?7 ℃搖動(dòng)孵育1～1.5 h，洗膜后滴加顯色液，拍照。

1.3.5.4 單克隆抗體親和力測(cè)定

采用間接ELISA方法[27]，將豬骨骼肌肌鈣蛋白檢測(cè)原按質(zhì)量濃度梯度（1、0.5、0.25、0.125 μg/mL）進(jìn)行包被;對(duì)每個(gè)檢測(cè)原質(zhì)量濃度下，均用含0.1%吐溫-20的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液將單克隆抗體按照1∶10、1∶30、1∶90、1∶270、1∶810、1∶2 430、1∶7 290、1∶21 870、1∶65 610、1∶196 830、1∶590 490、1∶1 771 470、1∶5 314 410、1∶15 943 230和1∶47 829 690做倍比稀釋?zhuān)靠准尤?00 μL，37 ℃孵育45 min，洗滌，拍干;每孔加入100 μL山羊抗小鼠IgG二抗（稀釋比例1∶10 000），37 ℃孵育30 min，洗滌，拍干;每孔加入100 μL顯色液，37 ℃避光反應(yīng)12 min;每孔加入50 μL終止液，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。以抗體濃度的對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)OD值作為縱坐標(biāo)，繪制曲線。根據(jù)下式計(jì)算親和力常數(shù)。

式中：Ab和Ab分別表示抗原稀釋中2 個(gè)不同豬骨骼肌肌鈣蛋白檢測(cè)原質(zhì)量濃度下OD=1/2ODmax時(shí)分別對(duì)應(yīng)的抗體濃度;n表示對(duì)應(yīng)豬骨骼肌肌鈣蛋白檢測(cè)原質(zhì)量濃度間的稀釋倍數(shù)。4 個(gè)質(zhì)量濃度下分別計(jì)算Ka后，結(jié)果取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件、GraphPad Prism 8作圖軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬、牛、羊、雞、鴨骨骼肌免疫原及檢測(cè)原的提取結(jié)果

由表1可知，分別取豬、牛、羊、雞、鴨骨骼肌肌肉組織，豬骨骼肌提取后得到蛋白提取物中免疫原及檢測(cè)原質(zhì)量濃度分別為5.4 mg/mL和9.0 mg/mL，得率分別為0.28%和2.24%。牛、羊、雞、鴨骨骼肌檢測(cè)原蛋白質(zhì)量濃度分別為8.4、12.0、17.8、15.5 mg/mL，得率分別為2.09%、2.32%、3.63%和3.30%。

2.2 豬、牛、羊、雞、鴨骨骼肌免疫原及檢測(cè)原的SDS-PAGE結(jié)果

由圖1可知，5 種動(dòng)物的骨骼肌肌鈣蛋白提取后，蛋白條帶清晰且顏色較深的共有條帶主要有2 條。在37 kDa（sTn T）和24 kDa（sTn I）處，豬免疫原及豬、牛、羊、雞、鴨檢測(cè)原均有清晰條帶，其中豬免疫原條帶最為明顯，但24 kDa處不及37 kDa處明顯，牛、羊、豬檢測(cè)原在24 kDa處條帶較淺。此外，在18 kDa處（sTn C）牛、羊檢測(cè)原有較清晰條帶，其余檢測(cè)原沒(méi)有;雞檢測(cè)原在15 kDa處有1 條特異條帶，鴨檢測(cè)原在16 kDa處有1 條特異條帶。以上結(jié)果表明，在蛋白提取過(guò)程中不同肌鈣蛋白亞型在不同物種中的損失程度不同。

泳道1. 豬免疫原;泳道2. 豬檢測(cè)原;泳道3. 雞檢測(cè)原;泳道4. 鴨檢測(cè)原;泳道5. 羊檢測(cè)原;泳道6. 牛檢測(cè)原。

2.3 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

融合7 d后，用間接ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清，篩選出抗體分泌為陽(yáng)性的孔，經(jīng)過(guò)3～4 次亞克隆至全陽(yáng)，得到1 株單克隆抗體細(xì)胞株，命名為2E8。由表2可知，單克隆抗體2E8經(jīng)純化后，測(cè)得其蛋白質(zhì)量濃度為6.2 mg/mL;包被豬檢測(cè)原質(zhì)量濃度2 μg/mL時(shí)，其效價(jià)為1∶4.1×105。

2.4 單克隆抗體2E8亞型測(cè)定結(jié)果

由圖2可知，2E8與IgG2a反應(yīng)的A450 nm為2.49，與其他亞類(lèi)抗體反應(yīng)的A450 nm均很低，因此，細(xì)胞株2E8分泌的抗體亞型為IgG2a。

2.5 單克隆抗體2E8特異性測(cè)定結(jié)果

2.5.1 間接ELISA法檢測(cè)結(jié)果

由圖3可知，單克隆抗體2E8與豬檢測(cè)原反應(yīng)的效價(jià)為1∶4.1×105，與雞、鴨檢測(cè)原反應(yīng)的效價(jià)均為1∶1.0×105，交叉反應(yīng)率為25%;與牛、羊檢測(cè)原反應(yīng)的效價(jià)較低，分別為1∶6.4×103、1∶2.6×104，交叉反應(yīng)率分別為1.7%、6.3%。以上結(jié)果表明，單克隆抗體2E8可以在一定程度上區(qū)分豬骨骼肌提取物與牛、羊、雞、鴨的骨骼肌提取物。

2.5.2 免疫印記檢測(cè)結(jié)果

泳道1. 鴨免疫原;泳道2. 雞檢測(cè)原;泳道3. 羊檢測(cè)原;泳道4. 牛檢測(cè)原;泳道5. 豬檢測(cè)原。

由圖4可知，免疫印跡結(jié)果顯示，在37 kDa（sTn T）處，單克隆抗體2E8與豬檢測(cè)原反應(yīng)明顯，條帶清晰，與羊、雞、鴨檢測(cè)原反應(yīng)輕微，與牛檢測(cè)原幾乎不反應(yīng)。這說(shuō)明單克隆抗體2E8可以特異性結(jié)合豬骨骼肌肌鈣蛋白T亞基（sTn T），與羊、雞、鴨骨骼肌肌鈣蛋白T有輕微交叉反應(yīng)，與牛骨骼肌肌鈣蛋白T無(wú)交叉反應(yīng)。

間接ELISA與免疫印跡的分析結(jié)果均表明，單克隆抗體2E8雖然能在一定程度上區(qū)分豬骨骼肌提取物與牛、羊、雞、鴨的骨骼肌提取物，但與牛、羊、雞、鴨的骨骼肌提取物均存在一定的交叉反應(yīng)。這與豬、牛、羊、雞、鴨的骨骼肌肌鈣蛋白的氨基酸序列具有高相似性有關(guān)。

2.6 單克隆抗體親和力常數(shù)

采用間接ELISA法測(cè)定4 種包被質(zhì)量濃度下的抗原與倍比稀釋的抗體反應(yīng)的OD值，繪制單克隆抗體2E8的親和力曲線。通過(guò)GraphPad Prism 8軟件計(jì)算OD=1/2ODmax時(shí)對(duì)應(yīng)的抗體物質(zhì)的量濃度，4 個(gè)質(zhì)量濃度下分別計(jì)算Ka后，取平均值，最終獲得單克隆抗體2E8的親和力常數(shù)

Ka=5.14×106 L/mol。

3 結(jié) 論

采用2 種骨骼肌肌鈣蛋白提取的方式，分別提取豬骨骼肌肌鈣蛋白免疫原與豬、牛、羊、雞、鴨骨骼肌肌鈣蛋白檢測(cè)原，選擇免疫效果好的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，3 次亞克隆后最終篩選獲得抗豬骨骼肌肌鈣蛋白的抗體1 株，命名為2E8。通過(guò)間接ELISA方法對(duì)抗體的特征進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，單克隆抗體2E8為IgG2a亞型;與牛、羊、雞、鴨的交叉反應(yīng)率分別為1.7%、6.3%、25%、25%;親和力常數(shù)為5.14×106 L/mol;免疫印記結(jié)果顯示抗體2E8能夠結(jié)合豬骨骼肌肌鈣蛋白T亞基。以上結(jié)果表明單克隆抗體2E8可以在一定程度上區(qū)分豬、牛、羊、雞、鴨的骨骼肌蛋白提取物，為肉類(lèi)摻假快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供理論與技術(shù)支持。

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